EQUIPO 3 _TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
La práctica de transformación bacteriana con pGLO a pesar de no ser la que correspondía a la práctica designada a ese día que era mini preparaciones de plásmidos, resultó de manera satisfactoria ya que gracias a la ayuda de una profesora de otro grupo que nos proporcionó el plásmido pudimos realizar esta práctica.
Durante el desarrollo de esta práctica tuvimos que descongelar las células en hielo durante unos 15 minutos (aprox.) alternando con el calor de las manos, aumentando la higiene en las manos para no contaminarlas, (lavando las manos antes de tomar las muestras y desinfectando la mesa de trabajo) cuando estas estuvieron listas, el profesor le agrego 10ng del plásmido proporcionado a la muestra etiquetada con pGLO + ya que la muestra de pGLO- es la muestra de control y ambos fueron mezclados por inversión y se les dejo en agua hielo durante 20 minutos y después se le dio un choque térmico por 45 segundos para después ser regresados al agua hielo 5 minutos. Con ayuda de una micro-pipeta el profesor agrego 900 µL del medio LB preparado por nosotros en la práctica anterior y fue incubado durante 40 minutos a 37°, después de esto fue centrifugado y retirado el sobrenadante para que quedara el “botón” con E-coli.
Se repartieron a todos los equipos los medios de cultivo preparados la sesión pasada para cultivar las muestras de pGLO + y pGLO – y ser observadas después de 36 horas bajo luz UV y luz blanca.
En si lo más “pesado” de esta práctica es la espera que se requiere en ciertos pasos y que contábamos con poco de este y por ese motivo en algunos de los pasos que requerían tiempo se tuvo que reducir 10 o 20 minutos.
En los medios de cultivo sembrados con E- coli se presentarón los siguientes resultados:
Medio pGLO Resultado Luminiscencia
LB* y Ampicilina + Crecimiento de colonias No
LB* - Crecimiento de colonias No
LB, Ampicilina y
arabinosa + Crecimiento de colonias Si
LB* y Ampicilina - Crecimiento de colonias No
LB* - Crecimiento de colonias No
LB, Ampicilina y
Arabinosa + Crecimiento de colonias Si
sábado, 22 de mayo de 2010
domingo, 16 de mayo de 2010
Discusion Eq 1 Pract 8 Transformación
En el pGLO – LB hubo presencia de colonias color blanco. El medio de cultivo y las condiciones adecuadas permitieron el crecimiento apropiado de las bacterias como se esperó. Estas bacterias no presentaron la fluorescencia ya que no tenían la proteína verde fluorescente que contenía el plásmido.
En el pGLO – LB ampicilina hubo presencia de unas cuantas colonias de bacterias color blanco. Los resultados esperados bajo las condiciones de la ampicilina eran la ausencia de colonias por la presencia de este antibiótico. Al no poseer el plásmido la ampicilina inhibe la síntesis de la pared celular microbiana y produce la muerte. El hecho de que hubo presencia de bacterias en la caja petri puede ser debido a que la bacteria haya presentado un mecanismo de resistencia al antibiótico. Estos surgen en las poblaciones por mutación y se establecen por la selección que ejerce la presencia del antibiótico en las poblaciones de los microorganismos. Otra posible respuesta a dicha presencia de bacterias es que el medio se pudo haber contaminado con otro tipo de bacterias que se encontraban presente en el ambiente y que no tienen la sensibilidad a la ampicilina debido a que este antibiótico es de espectro limitado; actúa sólo en un sector restringido (cocos gram negativos y gram positivos, espiroquetas y bacterias gram positivas). Ahora bien, si las bacterias que crecieron en el medio son resistentes al antibiótico debieron de haber crecido de igual forma que las bacterias en el pGLO + LB ampicilina, y crecieron muy poco, lo que nos dice que tienen cierta sensibilidad al antibiótico.
En el pGLO + LB ampicilina las bacterias crecieron apropiadamente y se observó un número alto de colonias color blanco. Estas bacterias adquirieron resistencia antibiótica por medio de la transferencia horizontal de genes que ya son resistentes a antibióticos, alterando los genes de la célula transformada. El plásmido pGLO inyectado en las bacterias presentaba un gen resistente a la ampicilina, y al incorporarse en el ADN de la bacteria transformadora traspasó a esta dicha característica. Estas bacterias no presentaron fluorescencia ya que el medio de cultivo no contenía arabinosa; dicho sustrato activa al gen del plásmido que produce la fluorescencia.
En el pGLO + LB ampicilina arabinosa las bacterias crecieron como se esperó con un color verde fluorescente. Esta característica fue otorgada del mismo modo que la resistencia antibiótica: por transformación. En este caso hay nuevamente resistencia frente al antibiótico (característica del pGLO). Todas estas bacterias transformadas con pGLO presentan a su vez la proteína fluorescente que da el color. Las células originales se dividieron y multiplicaron en colonias idénticas. Lo que provocó el color verde fluorescente en las células transformadoras fue la activación de la proteína (GFP) por medio de la azúcar arabinosa que se añadió al medio de cultivo. Esta azúcar dio la señal a la enzima DNA polimerasa para que sintetice la proteína expresando el color.
En el pGLO – LB ampicilina hubo presencia de unas cuantas colonias de bacterias color blanco. Los resultados esperados bajo las condiciones de la ampicilina eran la ausencia de colonias por la presencia de este antibiótico. Al no poseer el plásmido la ampicilina inhibe la síntesis de la pared celular microbiana y produce la muerte. El hecho de que hubo presencia de bacterias en la caja petri puede ser debido a que la bacteria haya presentado un mecanismo de resistencia al antibiótico. Estos surgen en las poblaciones por mutación y se establecen por la selección que ejerce la presencia del antibiótico en las poblaciones de los microorganismos. Otra posible respuesta a dicha presencia de bacterias es que el medio se pudo haber contaminado con otro tipo de bacterias que se encontraban presente en el ambiente y que no tienen la sensibilidad a la ampicilina debido a que este antibiótico es de espectro limitado; actúa sólo en un sector restringido (cocos gram negativos y gram positivos, espiroquetas y bacterias gram positivas). Ahora bien, si las bacterias que crecieron en el medio son resistentes al antibiótico debieron de haber crecido de igual forma que las bacterias en el pGLO + LB ampicilina, y crecieron muy poco, lo que nos dice que tienen cierta sensibilidad al antibiótico.
En el pGLO + LB ampicilina las bacterias crecieron apropiadamente y se observó un número alto de colonias color blanco. Estas bacterias adquirieron resistencia antibiótica por medio de la transferencia horizontal de genes que ya son resistentes a antibióticos, alterando los genes de la célula transformada. El plásmido pGLO inyectado en las bacterias presentaba un gen resistente a la ampicilina, y al incorporarse en el ADN de la bacteria transformadora traspasó a esta dicha característica. Estas bacterias no presentaron fluorescencia ya que el medio de cultivo no contenía arabinosa; dicho sustrato activa al gen del plásmido que produce la fluorescencia.
En el pGLO + LB ampicilina arabinosa las bacterias crecieron como se esperó con un color verde fluorescente. Esta característica fue otorgada del mismo modo que la resistencia antibiótica: por transformación. En este caso hay nuevamente resistencia frente al antibiótico (característica del pGLO). Todas estas bacterias transformadas con pGLO presentan a su vez la proteína fluorescente que da el color. Las células originales se dividieron y multiplicaron en colonias idénticas. Lo que provocó el color verde fluorescente en las células transformadoras fue la activación de la proteína (GFP) por medio de la azúcar arabinosa que se añadió al medio de cultivo. Esta azúcar dio la señal a la enzima DNA polimerasa para que sintetice la proteína expresando el color.
jueves, 13 de mayo de 2010
Equipo 2 Discusión de practica 4: cinética enzimática
Realizando la observación de las gráficas que se obtienen en los resultados, se puede apreciar la forma en que interactúa Vo con cada uno de los datos obtenidos, en la realización de la práctica, o bien, en los cálculos realizados para poder hacer las gráficas. Se observa que todos los datos afectan de manera directa la acción de la velocidad de la reacción modificando Vo si se modifica alguno de estos datos. Por
Por otra parte, se obtuvieron los valores de la velocidad de reacción de la enzima, en una grafica que al principio se describe como lineal, porque a bajas concentraciones de sustrato la enzima permanece en equilibrio constante, pero con el aumento de la concentración se va curvando, identificando por varios métodos, como el de Michaelis-Menten, la velocidad inicial o media a partir de la Vmax que se usa como un valor constante, y la afinidad de la enzima sobre los sustratos (Km); la diferencia entre estos es la facilidad que hay dentro de sus ecuaciones para distinguir a Km y Vmax.
En dicha grafica se observa el tiempo y la velocidad inicial en la pendiente, la inversa de la Vmax en el corte con el eje de las ordenadas, y el valor de -1/Km en las abscisas, siendo que 1(S) se iguala a 0 y es el valor mínimo posible, pero con este se hayan estimaciones inexactas.
Por otra parte, se obtuvieron los valores de la velocidad de reacción de la enzima, en una grafica que al principio se describe como lineal, porque a bajas concentraciones de sustrato la enzima permanece en equilibrio constante, pero con el aumento de la concentración se va curvando, identificando por varios métodos, como el de Michaelis-Menten, la velocidad inicial o media a partir de la Vmax que se usa como un valor constante, y la afinidad de la enzima sobre los sustratos (Km); la diferencia entre estos es la facilidad que hay dentro de sus ecuaciones para distinguir a Km y Vmax.
En dicha grafica se observa el tiempo y la velocidad inicial en la pendiente, la inversa de la Vmax en el corte con el eje de las ordenadas, y el valor de -1/Km en las abscisas, siendo que 1(S) se iguala a 0 y es el valor mínimo posible, pero con este se hayan estimaciones inexactas.
sábado, 8 de mayo de 2010
Discusión Eq 1 Prac 5 Cinetica Enz
En la práctica se analizó la absorbancia de DOPA que tuvieron cada uno de los tubos, los cuales contenían diferente cantidad de amortiguador de fosfato 0.1 M y solución de L-DOPA.
Además de calculó la masa de DOPA, la concentración de sustrato y la velocidad.
En la tabla 1 se puede ver la absorbancia de cada uno de los tubos en intervalos de 10 segundos y nos dio que los tubos 5 y 6 fueron los de mayor absorbancia de DOPA, pues fueron a los tubos que se les puso la mayor cantidad de L-DOPA, teniendo 1.25 ml el tubo 5, y 1.5 ml el tubo 6.
En las gráficas 1 y 2 observamos cómo fue siendo la absorbancia de DOPA y su regresión lineal.
Vemos como el tubo 1 tiene una absorbancia 0, pues no tenía nada de L-DOPA, se le vertió puro amortiguador de fosfato 0.1 M.
Con forme se le fue añadiendo la solución L-DOPA, el grado de absorbancia fue siendo mayor, hasta llegar a 0.51 en el tubo 6 a los 90 segundos.
En la tabla 2 se pueden ver los resultado obtenidos después de hacer los cálculos para sacar la masa, concentración, pendientes, velocidad, y así poder hacer las gráficas requeridas para la cinética.
La Gráfica 3 nos da la velocidad que tuvo la reacción en función de la concentración del sustrato en mM. Vemos como la velocidad va aumentando pero al llegar a cierto punto en que la concentración también aumenta, la velocidad disminuye. Esto se debe a que en las reacciones enzimáticas, llega un momento en el cual la velocidad llega a un tope, y es cuando se dice que está saturada la enzima.
La Gráfica 4 es la representación gráfica de Lineweaver-Burk, relacionando 1/v por 1/s, la cual permite identificar el Km y Vmax.
Entonces se sacó la velocidad máxima y nos dio que es de 0.0747 Mm/min, y así también se sacó la Km, dándonos un resultado de 5.6493 mM.
En la Gráfica 5 se d ala representación de gráfica de Eadie Hofstee, la cual relaciona la velocidad de la reacción con la concentración del sustrato. Calculando dio una velocidad máxima de 0.0476 Mm/min y un Km de 2.8281 mM.
El digrama Eadie-Hofstee está menos afectada por el margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke, debido a que asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentración del sustrato o de la velocidad de reacción, por lo que debemos de hacerle más caso a los resultados obtenidos por este método que por el de Lineweaver-Burke.
Fijándonos en la Gráfica 3 se ve como la velocidad más máxima a la que llega la reacción si concuerda con los datos obtenidos por el método de Eadie Hofstee.
jueves, 6 de mayo de 2010
TRANSFORMACION BACTERIANA CON pGLO
En este practica se realizará una transformación genética. Un gen es un pedazo de DNA el cual provee las instrucciones para hacer (o codifica para) una proteína. Esta proteína le da a un organismo una característica particular.
La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material genético (DNA). Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación. Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo.
La transformación genética es utilizada en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura genes que codifican para características como la resistencia en contra de descomposición, congelación y alimañas pueden ser transformadas genéticamente en las plantas. En la biorremediación, bacterias pueden ser genéticamente transformadas con genes que le permiten digerir derrames de petróleo. En la medicina, enfermedades causadas por genes defectuosos se están empezando a tratar con terapia genética; en otras palabras se transforma genéticamente la célula de una persona enferma con copia sana del gen defectuoso que causa la enfermedad.
En la practica se utilizará un procedimiento que transformará la bacteria E. coli con un gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extraído de una medusa o “agua viva” llamada Aequorea victoria que es fluorescente y bioluminiscente. La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.
Las bacterias además de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos (uno o más de estos). El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características que pueden ser beneficiosas para la sobrevivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias pueden transferir plásmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. El plásmido pGLO contiene el gen para hacer la GFP.
Los plásmidos pGLO únicos de Bio-Rad contienen además un gen de resistencia al antibiótico ampicilina (amp). El pGLO también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células.
La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material genético (DNA). Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación. Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo.
La transformación genética es utilizada en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura genes que codifican para características como la resistencia en contra de descomposición, congelación y alimañas pueden ser transformadas genéticamente en las plantas. En la biorremediación, bacterias pueden ser genéticamente transformadas con genes que le permiten digerir derrames de petróleo. En la medicina, enfermedades causadas por genes defectuosos se están empezando a tratar con terapia genética; en otras palabras se transforma genéticamente la célula de una persona enferma con copia sana del gen defectuoso que causa la enfermedad.
En la practica se utilizará un procedimiento que transformará la bacteria E. coli con un gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extraído de una medusa o “agua viva” llamada Aequorea victoria que es fluorescente y bioluminiscente. La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.
Las bacterias además de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos (uno o más de estos). El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características que pueden ser beneficiosas para la sobrevivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias pueden transferir plásmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. El plásmido pGLO contiene el gen para hacer la GFP.
Los plásmidos pGLO únicos de Bio-Rad contienen además un gen de resistencia al antibiótico ampicilina (amp). El pGLO también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células.
lunes, 3 de mayo de 2010
Equipo 2. Introducción de práctia 6 minipreparaciones de plásmido PGLO
¿QUÉ ES UN PLÁSMIDO?
Son pequeñas moléculas del DNA extracromosómico que aparecen en el citoplasma y que aportan solamente unos genes; se pueden llamar como plásmidos ó episomas según con la relación genética con el DNA cromosómico. La mayoría de las células contiene de 1 a 20 moléculas de plásmidos, estos se parecen en tamaño a los DNAs virales, están comprendidos entre 5 y100 megadaltones, se replican en números fijos junto con los cromosomas, los llamados episomas se incorporan al cromosoma de la célula huésped. Los plásmidos pueden ser transferidos de una célula bacteriana a otra durante la conjugación sexuada, confiriendo así nuevas características fenotípicas a la célula recipiendaria. Las bacterias, a diferencia de las células eucariotas (por ejemplo las que forman nuestro cuerpo) a parte de su ADN genómico heredado o cromosoma bacteriano, poseen otro tipo de ADN que "se lo pasan" de unas a otras. Es lo que se llama la herencia o transferencia horizontal. Una bacteria se encuenentra a otra y es capaz de pasarle de forma fisiológica y controlada una copia de ese ADN. Pues bien esos ADN son los "plásmidos". Son trozos de ADN circulares y cerrados covalentemente (ccc) y les sirven porque gracias a ellos adquieren algún caracter fenótípico nuevo, por ejemplo, resistencia a la ampicilina.
Pues bien, la utilización de estos plásmidos en los laboratorios ha representado uno de los mayores avances en la ciencia de los últimos 40 años.
Si se toma ese plásmido, se abre por un sitio para dejarlo lineal y a eso le unes un trozo de ADN o un gen (que a tí te interesa investigar)y posteriormente lo cierras de nuevo para dejarlo circular, hemos conseguido vectorizar ese trozo de ADN que nos interesa y ahora somos capaces de "meterlo" dentro de la bacteria reconociendolo como suyo. De otra forma, la bacteria rompería el ADN sin vectorizar.
¿QUÉ ES UN VECTOR DE CLONACIÓN?
LOS PLÁSMIDOS Y EL FAGO LAMBDA SON VECTORES DE ELECCIÓN PARA EL CLONADO DE DNA EN LAS BACTERIAS.
Uno de los plásmidos más útiles para el clonado es pBR322, que contiene genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina (un antibiótico análogo a la penicilina). Este plásmido contiene una serie de lugares concretos que pueden ser atacados por endonucleasas específicas para luego introducir fragmentos de DNA. La inserción de DNA en el punto de restricción de la EcoRI no altera ninguno de los dos genes de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, la inserción en los puntos de restricción de las HindIII. SalI o BamHI inactiva el gen de resistencia a la tetraciclina, un efecto que se denomina inactivación insercional. Las células que contienen el pBR322 con un DNA insertado son resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, y así pueden seleccionarse fácilmente. Las células que no consiguieron captar el vector son sensibles a los dos antibióticos, mientras que las que captaron el pBR322 sin DNA insertados son resistentes en ambos.
El fago lambda (ג) en otro vector ampliamente utilizado. Este bacteriófago puede disfrutar de do estilos de vida distintos: puede destruir a su hospedador, o bien puede pasar a formar parte de él. En el ciclo lítico las funciones víricas aparecen plenamente expresadas: el DNA y las proteínas víricas se producen rápidamente y se empaquetan en forma de partículas víricas, que llevan a la lisis (destrucción) de la célula hospedadora, y a la brusca aparición de una progenie de unas 100 partículas víricas o virones. En la ciclo lisogénico, el DNA del fago resulta integrado en el genoma de la célula que lo alberga y puede replicarse junto con el DNA de esta célula durante muchas generaciones permaneciendo inactivo. Ciertos cambios ambientales pueden desencadenar la expresión de este DNA vírico durmiente, con lo que tiene lugar la formación de progenie vírica y se desencadena la lisis del hospedador, Largas secuencias del DNA de 48 kb del fago ג no son esenciales para la infección lítica, y pueden ser remplazados por DNA extraño.
Se han construido fagos ג mutantes diseñados para el clonado del DNA, uno de estos mutantes especialmente utilizado, denominado גgt-גβ, contiene sólo dos puntos de escisión por el EcoRI, en vez de los cinco puntos habituales.
Después de la escisión, puede eliminarse el segmento central de esa molécula de DNA ג. Los dos fragmentos restantes de DNA tienen una longitud conjunta equivalente al 72% del genoma unitario. Esta cantidad de DNA resulta demasiado pequeña para empaquetarse en la cabeza del fago ג. La gama de longitudes que pueden empaquetarse fácilmente varían desde el 75 al 105% del genoma unitario. Sin embargo, la inserción de una cantidad adecuada del DNA ג hace posible la encapsulación de la molécula recombinante (un 93% de la longitud normal). Aproximadamente, todas las partículas ג infecciosas, formadas de esta manera, poseen un fragmento extraño de DNA insertado. Otra ventaja de utilizar como vectores estos virones modificados es que entran en las bacterias con mucha mayor frecuencia que los plásmidos. Para utilizarlos como vectores de clonación se han construido una serie de mutantes del fago ג. Uno de ellos, el llamado cósmido, puede servir como vehículo para grandes fragmentos de DNA (de hasta unas 45 kb).
El fago M13 es otro vector muy útil para clonar DNA. Este virus filamentoso tiene 900 mm de longitud y solo 9 mm de diámetro. Su molécula de DNA circular, de una hebra, de 6,4 kb, se halla protegida por una cápsida de 2710 subunidades proteicas. M13 pasa al interior de E. coli a través de un pilus sexual, una estructura proteica que sobresale de la bacteria. La hebra de DNA que se halla en la partícula vírica (llamada hebra +) se replica a través de una forma de replicación (RF) intermediaria de doble hebra, que contiene hebras + y -, de forma muy parecida a lo que ocurre con ØX174. Solo la hebra + se empaqueta en el interior de las nuevas partículas víricas. Cada generación consta de un millar de partículas de M13. Una notable característica del virus M13 es que no mata a su bacteria hospedadora. Por lo tanto, se puede obtener fácilmente grandes cantidades de M13 en cultivos (1g a partir de 10 L de medio cultivo líquido).
Para clonar con M13, su forma de replicación de DNA circular se corta en un único punto con un enzima de restricción. El corte se hace en una región multiadaptadora (“polylinker”) que contiene una serie de sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios aparece sólo una vez en el vector. La forma RF así abierta se liga a un fragmento de DNA extraño de doble hebra producido por el mismo enzima de restricción. El DNA extraño se puede insertar en el RF con dos orientaciones distintas, porque los extremos de ambas moléculas de DNA son indistinguibles. Por lo tanto, la mitad de las nuevas hebras + empaquetadas en las párticulas víricas van a contener una de las hebras del DNA extraño, y la otra mitad, la otra hebra. Al ser infectado un E. coli por una única partícula vírica se obtendrá una gran cantidad de DNA monocatenario de M13, que contendrá la información de la correspondiente hebra del DNA extraño. Para secuenciar el fragmento de DNA insertado, se utiliza como cebador un oligonucleótido que hibridiza la zona adyacente a la región multiadaptadora. Dicho oligómero se denomina cebador universal de secuenciación, ya que se puede usar para secuenciar cualquier fragmento insertado. El fago M13 es ideal para secuenciar DNA, pero no para propagar DNA recombinante a largo plazo, ya que en los fragmentos insertados mas de 1kb no se mantienen de modo estable en su genoma.
¿QUE ES UN PROMOTOR?
En el ADN este controla la iniciación de la transcripción de ese gen al ARN, este contiene la información para activar o desactivar el gen que regula.
Un promotor se une a la polimerasa, y se encuentra normalmente delante de una secuencia específica de RNA. en el RNA (incluido en el promotor) el primer nucleótido es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto. Delante - y detrás +. El resto del promotor no se transcribe.
En las células procariotas el promotor tiene dos zona comunes que son puntos de reconocimiento de polimerasa en las regiones -10 y -35. Esta secuencia de bases está bastante conservada: Región -10: TATAAT, Región -35: TTGACA
La eficiencia de la transcripción depende de lo bien que reconozca la polimerasa al promotor. Cuanto más se parece el promotor a los anteriores más fuerte es. Las proteínas tienen genes con promotores fuertes. Hay secuencias reguladoras de polimerasas en el mismo promotor.
En un operón hay un promotor controlando la transcripción de varios genes juntos y al final hay una terminación común para todos.
En la transcripción, la RNA polímerasa se une a cualquier sitio de la molécula y busca el promotor rápidamente deslizándose hasta encontrarlo. Se posa donde ve un promotor, pero otras órdenes exteriores le indican el promotor correcto, reconociéndolo estableciendo puentes de hidrógeno en uno determinado. Las zonas de interacción son -10 y -35 dentro del promotor. Cuanto más fuerte sea el promotor más interacciones podrá formar. Este proceso es rápido porque para reconocer promotores no es necesario desenrollar el promotor, se leen las bases a través del surco mayor. En el reconocimiento del promotor interviene σ
En las eucariotas, todos los genes tienen promotor y término. No hay policistrónicos. Con mucha frecuencia en los promotores se da una secuencia llamada caja TATA que está en la región -20. No hay zona en -35.
En la transcripción de las eucariotas, se requiere la presencia de proteínas para reconocer promotores, estos factores transcripcionales se unen al promotor formando un complejo que se une al RNA polimerasa.
En un complejo cerrado, la polimerasa se fija al promotor produciendo un cambio conformacional que da lugar al complejo abierto. Se separan las dos cadenas del promotor del DNA, lo que da lugar a una burbuja de transcripción. La burbuja se desplaza y se sintetizan unos 5 nucleótidos antes de abandonar el promotor.Una parte grande del promotor no se copia en el DNA sino a partir de +1.
¿QUE ES UN OPERON?
Un Operón se define como una unidad genética funcional formada por un grupo o complejo de genes capaces de ejercer una regulación de su propia expresión por medio de los sustratos con los que interaccionan las proteínas codificadas por sus genes. Este complejo esta formado por genes estructurales que codifican para la síntesis de proteínas (generalmente enzimas), que participan en vías metabólicas cuya expresión generalmente está regulada por otros 2 factores de control, llamados: Factor promotor ,Operador.
El operador permite la activación/desactivación del promotor a modo de "interruptor génico" por medio de su interacción con un compuesto inductor. Y de esta manera el promotor dará lugar a la expresión/represión del resto de los genes estructurales.
Un operón es también un conjunto de genes bacterianos que se co-transcriben en una misma molécula de RNA. Debido a la importancia biológica de los operones en coordinar la expresión de genes se encuentran metabólica o funcionalmente relacionados. En principio los genes que pertenecen a un operón podrían ser definidos si los elementos de regulación que delimitan el inicio (promotor) y el final de la transcripción (terminador ) de las unidades transcripcionales pudieran ser. Los operones, de acuerdo a la regulación que presenten, se clasifican como inducibles, reprensibles y constitutivos.
Los operones inducibles son aquellos operones que en condiciones normales no se expresan, pero, en respuesta a un agente inductor se activa, transcribiendo los genes estructurales. El ejemplo clásico de este tipo de operon lo constituye el operon lactosa. Otros ejemplos de operones inducibles son aquellos que codifican para enzimas que participan en el metabolismo de sustratos como operon maltosa, arabinosa, etc...Los operones reprensibles son aquellos operones que en condiciones normales sí se expresan, pero, en respuesta a un agente represor se activan, inhibiendo la transcripción de los genes estructurales. Ejemplos de este tipo de operon son los operones que codifican para la síntesis de aminoácidos, como operon trp, his, etc...Los operones constitutivos son aquellos operones que siempre se expresan, y por lo tanto no están regulados ni por inductores ni por represores.
OPERÓN ARABINOSA
El operón de arabinosa está compuesto por los genes de las enzimas de la arabinosa.
Este tipo de operón es un ejemplo de operón inducible, en este operón la misma proteína reguladora es ejerce control tanto positivo como negativo.
Los genes ara A, B y D son lo que participan en el metabolismo de azúcar arabinosa, y estos se encuentran rregulados por una proteína codificada por la ara C. En ausencia de arabinosa la proteína se puede comportar como un represor haciendo que se una a otros sitios reguladores como en arao o araI, en este caso no ocurre transcripción y el control es negativo.
En presencia de arabinosa se realiza algo parecido a un activador y se estimula la transcripción de ara A, B y D y para este caso el control es positivo.
Stryer L. Bioquímica Cuarta edición tomo I Y II; Reverté, Barcelona 1995 España pp.128-130, 826-27, 950-52, 956-57.
Son pequeñas moléculas del DNA extracromosómico que aparecen en el citoplasma y que aportan solamente unos genes; se pueden llamar como plásmidos ó episomas según con la relación genética con el DNA cromosómico. La mayoría de las células contiene de 1 a 20 moléculas de plásmidos, estos se parecen en tamaño a los DNAs virales, están comprendidos entre 5 y100 megadaltones, se replican en números fijos junto con los cromosomas, los llamados episomas se incorporan al cromosoma de la célula huésped. Los plásmidos pueden ser transferidos de una célula bacteriana a otra durante la conjugación sexuada, confiriendo así nuevas características fenotípicas a la célula recipiendaria. Las bacterias, a diferencia de las células eucariotas (por ejemplo las que forman nuestro cuerpo) a parte de su ADN genómico heredado o cromosoma bacteriano, poseen otro tipo de ADN que "se lo pasan" de unas a otras. Es lo que se llama la herencia o transferencia horizontal. Una bacteria se encuenentra a otra y es capaz de pasarle de forma fisiológica y controlada una copia de ese ADN. Pues bien esos ADN son los "plásmidos". Son trozos de ADN circulares y cerrados covalentemente (ccc) y les sirven porque gracias a ellos adquieren algún caracter fenótípico nuevo, por ejemplo, resistencia a la ampicilina.
Pues bien, la utilización de estos plásmidos en los laboratorios ha representado uno de los mayores avances en la ciencia de los últimos 40 años.
Si se toma ese plásmido, se abre por un sitio para dejarlo lineal y a eso le unes un trozo de ADN o un gen (que a tí te interesa investigar)y posteriormente lo cierras de nuevo para dejarlo circular, hemos conseguido vectorizar ese trozo de ADN que nos interesa y ahora somos capaces de "meterlo" dentro de la bacteria reconociendolo como suyo. De otra forma, la bacteria rompería el ADN sin vectorizar.
¿QUÉ ES UN VECTOR DE CLONACIÓN?
LOS PLÁSMIDOS Y EL FAGO LAMBDA SON VECTORES DE ELECCIÓN PARA EL CLONADO DE DNA EN LAS BACTERIAS.
Uno de los plásmidos más útiles para el clonado es pBR322, que contiene genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina (un antibiótico análogo a la penicilina). Este plásmido contiene una serie de lugares concretos que pueden ser atacados por endonucleasas específicas para luego introducir fragmentos de DNA. La inserción de DNA en el punto de restricción de la EcoRI no altera ninguno de los dos genes de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, la inserción en los puntos de restricción de las HindIII. SalI o BamHI inactiva el gen de resistencia a la tetraciclina, un efecto que se denomina inactivación insercional. Las células que contienen el pBR322 con un DNA insertado son resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, y así pueden seleccionarse fácilmente. Las células que no consiguieron captar el vector son sensibles a los dos antibióticos, mientras que las que captaron el pBR322 sin DNA insertados son resistentes en ambos.
El fago lambda (ג) en otro vector ampliamente utilizado. Este bacteriófago puede disfrutar de do estilos de vida distintos: puede destruir a su hospedador, o bien puede pasar a formar parte de él. En el ciclo lítico las funciones víricas aparecen plenamente expresadas: el DNA y las proteínas víricas se producen rápidamente y se empaquetan en forma de partículas víricas, que llevan a la lisis (destrucción) de la célula hospedadora, y a la brusca aparición de una progenie de unas 100 partículas víricas o virones. En la ciclo lisogénico, el DNA del fago resulta integrado en el genoma de la célula que lo alberga y puede replicarse junto con el DNA de esta célula durante muchas generaciones permaneciendo inactivo. Ciertos cambios ambientales pueden desencadenar la expresión de este DNA vírico durmiente, con lo que tiene lugar la formación de progenie vírica y se desencadena la lisis del hospedador, Largas secuencias del DNA de 48 kb del fago ג no son esenciales para la infección lítica, y pueden ser remplazados por DNA extraño.
Se han construido fagos ג mutantes diseñados para el clonado del DNA, uno de estos mutantes especialmente utilizado, denominado גgt-גβ, contiene sólo dos puntos de escisión por el EcoRI, en vez de los cinco puntos habituales.
Después de la escisión, puede eliminarse el segmento central de esa molécula de DNA ג. Los dos fragmentos restantes de DNA tienen una longitud conjunta equivalente al 72% del genoma unitario. Esta cantidad de DNA resulta demasiado pequeña para empaquetarse en la cabeza del fago ג. La gama de longitudes que pueden empaquetarse fácilmente varían desde el 75 al 105% del genoma unitario. Sin embargo, la inserción de una cantidad adecuada del DNA ג hace posible la encapsulación de la molécula recombinante (un 93% de la longitud normal). Aproximadamente, todas las partículas ג infecciosas, formadas de esta manera, poseen un fragmento extraño de DNA insertado. Otra ventaja de utilizar como vectores estos virones modificados es que entran en las bacterias con mucha mayor frecuencia que los plásmidos. Para utilizarlos como vectores de clonación se han construido una serie de mutantes del fago ג. Uno de ellos, el llamado cósmido, puede servir como vehículo para grandes fragmentos de DNA (de hasta unas 45 kb).
El fago M13 es otro vector muy útil para clonar DNA. Este virus filamentoso tiene 900 mm de longitud y solo 9 mm de diámetro. Su molécula de DNA circular, de una hebra, de 6,4 kb, se halla protegida por una cápsida de 2710 subunidades proteicas. M13 pasa al interior de E. coli a través de un pilus sexual, una estructura proteica que sobresale de la bacteria. La hebra de DNA que se halla en la partícula vírica (llamada hebra +) se replica a través de una forma de replicación (RF) intermediaria de doble hebra, que contiene hebras + y -, de forma muy parecida a lo que ocurre con ØX174. Solo la hebra + se empaqueta en el interior de las nuevas partículas víricas. Cada generación consta de un millar de partículas de M13. Una notable característica del virus M13 es que no mata a su bacteria hospedadora. Por lo tanto, se puede obtener fácilmente grandes cantidades de M13 en cultivos (1g a partir de 10 L de medio cultivo líquido).
Para clonar con M13, su forma de replicación de DNA circular se corta en un único punto con un enzima de restricción. El corte se hace en una región multiadaptadora (“polylinker”) que contiene una serie de sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios aparece sólo una vez en el vector. La forma RF así abierta se liga a un fragmento de DNA extraño de doble hebra producido por el mismo enzima de restricción. El DNA extraño se puede insertar en el RF con dos orientaciones distintas, porque los extremos de ambas moléculas de DNA son indistinguibles. Por lo tanto, la mitad de las nuevas hebras + empaquetadas en las párticulas víricas van a contener una de las hebras del DNA extraño, y la otra mitad, la otra hebra. Al ser infectado un E. coli por una única partícula vírica se obtendrá una gran cantidad de DNA monocatenario de M13, que contendrá la información de la correspondiente hebra del DNA extraño. Para secuenciar el fragmento de DNA insertado, se utiliza como cebador un oligonucleótido que hibridiza la zona adyacente a la región multiadaptadora. Dicho oligómero se denomina cebador universal de secuenciación, ya que se puede usar para secuenciar cualquier fragmento insertado. El fago M13 es ideal para secuenciar DNA, pero no para propagar DNA recombinante a largo plazo, ya que en los fragmentos insertados mas de 1kb no se mantienen de modo estable en su genoma.
¿QUE ES UN PROMOTOR?
En el ADN este controla la iniciación de la transcripción de ese gen al ARN, este contiene la información para activar o desactivar el gen que regula.
Un promotor se une a la polimerasa, y se encuentra normalmente delante de una secuencia específica de RNA. en el RNA (incluido en el promotor) el primer nucleótido es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto. Delante - y detrás +. El resto del promotor no se transcribe.
En las células procariotas el promotor tiene dos zona comunes que son puntos de reconocimiento de polimerasa en las regiones -10 y -35. Esta secuencia de bases está bastante conservada: Región -10: TATAAT, Región -35: TTGACA
La eficiencia de la transcripción depende de lo bien que reconozca la polimerasa al promotor. Cuanto más se parece el promotor a los anteriores más fuerte es. Las proteínas tienen genes con promotores fuertes. Hay secuencias reguladoras de polimerasas en el mismo promotor.
En un operón hay un promotor controlando la transcripción de varios genes juntos y al final hay una terminación común para todos.
En la transcripción, la RNA polímerasa se une a cualquier sitio de la molécula y busca el promotor rápidamente deslizándose hasta encontrarlo. Se posa donde ve un promotor, pero otras órdenes exteriores le indican el promotor correcto, reconociéndolo estableciendo puentes de hidrógeno en uno determinado. Las zonas de interacción son -10 y -35 dentro del promotor. Cuanto más fuerte sea el promotor más interacciones podrá formar. Este proceso es rápido porque para reconocer promotores no es necesario desenrollar el promotor, se leen las bases a través del surco mayor. En el reconocimiento del promotor interviene σ
En las eucariotas, todos los genes tienen promotor y término. No hay policistrónicos. Con mucha frecuencia en los promotores se da una secuencia llamada caja TATA que está en la región -20. No hay zona en -35.
En la transcripción de las eucariotas, se requiere la presencia de proteínas para reconocer promotores, estos factores transcripcionales se unen al promotor formando un complejo que se une al RNA polimerasa.
En un complejo cerrado, la polimerasa se fija al promotor produciendo un cambio conformacional que da lugar al complejo abierto. Se separan las dos cadenas del promotor del DNA, lo que da lugar a una burbuja de transcripción. La burbuja se desplaza y se sintetizan unos 5 nucleótidos antes de abandonar el promotor.Una parte grande del promotor no se copia en el DNA sino a partir de +1.
¿QUE ES UN OPERON?
Un Operón se define como una unidad genética funcional formada por un grupo o complejo de genes capaces de ejercer una regulación de su propia expresión por medio de los sustratos con los que interaccionan las proteínas codificadas por sus genes. Este complejo esta formado por genes estructurales que codifican para la síntesis de proteínas (generalmente enzimas), que participan en vías metabólicas cuya expresión generalmente está regulada por otros 2 factores de control, llamados: Factor promotor ,Operador.
El operador permite la activación/desactivación del promotor a modo de "interruptor génico" por medio de su interacción con un compuesto inductor. Y de esta manera el promotor dará lugar a la expresión/represión del resto de los genes estructurales.
Un operón es también un conjunto de genes bacterianos que se co-transcriben en una misma molécula de RNA. Debido a la importancia biológica de los operones en coordinar la expresión de genes se encuentran metabólica o funcionalmente relacionados. En principio los genes que pertenecen a un operón podrían ser definidos si los elementos de regulación que delimitan el inicio (promotor) y el final de la transcripción (terminador ) de las unidades transcripcionales pudieran ser. Los operones, de acuerdo a la regulación que presenten, se clasifican como inducibles, reprensibles y constitutivos.
Los operones inducibles son aquellos operones que en condiciones normales no se expresan, pero, en respuesta a un agente inductor se activa, transcribiendo los genes estructurales. El ejemplo clásico de este tipo de operon lo constituye el operon lactosa. Otros ejemplos de operones inducibles son aquellos que codifican para enzimas que participan en el metabolismo de sustratos como operon maltosa, arabinosa, etc...Los operones reprensibles son aquellos operones que en condiciones normales sí se expresan, pero, en respuesta a un agente represor se activan, inhibiendo la transcripción de los genes estructurales. Ejemplos de este tipo de operon son los operones que codifican para la síntesis de aminoácidos, como operon trp, his, etc...Los operones constitutivos son aquellos operones que siempre se expresan, y por lo tanto no están regulados ni por inductores ni por represores.
OPERÓN ARABINOSA
El operón de arabinosa está compuesto por los genes de las enzimas de la arabinosa.
Este tipo de operón es un ejemplo de operón inducible, en este operón la misma proteína reguladora es ejerce control tanto positivo como negativo.
Los genes ara A, B y D son lo que participan en el metabolismo de azúcar arabinosa, y estos se encuentran rregulados por una proteína codificada por la ara C. En ausencia de arabinosa la proteína se puede comportar como un represor haciendo que se una a otros sitios reguladores como en arao o araI, en este caso no ocurre transcripción y el control es negativo.
En presencia de arabinosa se realiza algo parecido a un activador y se estimula la transcripción de ara A, B y D y para este caso el control es positivo.
Stryer L. Bioquímica Cuarta edición tomo I Y II; Reverté, Barcelona 1995 España pp.128-130, 826-27, 950-52, 956-57.
equipo 2. Discuión de práctica 3 Cuantificación de proteínas
En los resultados obtenidos se observa que la absorbancia de los tubos influye en la coloración que se obtiene en cada uno. Como se había observando de manera teórica, los tubos tomarían una coloración al agregarse el reactivo de Biuret, de acuerdo con la teoría los tubos tomaron la coloración azul o violeta dependiendo de la concentración de la proteína en cada tubo, en este caso representando el color azul cuando no había tanta proteína en el tubo y el color violeta o más intenso en un tubo con mayor cantidad de proteína. Por esto se puede observar que la absorbancia dependerá de la cantidad de proteína. Además se puede observar al llevar cada uno al espectrofotómetro que los tubos que contienen mayor cantidad de proteína indicaran una mayor cantidad visible de la absorbancia.
De acuerdo a los datos obtenidos por la gráfica que representa la cantidad de absorbancia de la proteína y con la curva patrón realizada con la albúmina, se tiene que según la teoría, los datos deberían de estar relacionados según el ajuste de mínimos cuadrados, es decir, debería de arrojarse como resultado que existe una relación entre la absorbancia y la concentración de la proteína, en este caso la teoría nos proporciona (al igual del punto anterior discutido) que realmente la cantidad de proteína será un punto definitivo para la coloración y la absorbancia que se obtendrá al realizar el proceso de espectrofotometría.
La gráfica nos arroja como resultado un dato de r = 1.003 junto con los cálculos realizados, en este caso r debería de ser lo más cercano posible a uno para que se viera que los datos si están relacionados, es este caso los datos de concentración de la proteína y la absorbancia, entonces debido a que el dato de r es casi uno se observa que la absorbancia dependerá directamente de la concentración que haya de proteína en la mezcla que se presenta.
De acuerdo a los datos obtenidos por la gráfica que representa la cantidad de absorbancia de la proteína y con la curva patrón realizada con la albúmina, se tiene que según la teoría, los datos deberían de estar relacionados según el ajuste de mínimos cuadrados, es decir, debería de arrojarse como resultado que existe una relación entre la absorbancia y la concentración de la proteína, en este caso la teoría nos proporciona (al igual del punto anterior discutido) que realmente la cantidad de proteína será un punto definitivo para la coloración y la absorbancia que se obtendrá al realizar el proceso de espectrofotometría.
La gráfica nos arroja como resultado un dato de r = 1.003 junto con los cálculos realizados, en este caso r debería de ser lo más cercano posible a uno para que se viera que los datos si están relacionados, es este caso los datos de concentración de la proteína y la absorbancia, entonces debido a que el dato de r es casi uno se observa que la absorbancia dependerá directamente de la concentración que haya de proteína en la mezcla que se presenta.
miércoles, 28 de abril de 2010
Equipo 3- Práctica 6 "Preparación de medios de cultivo para Escherichia coli y propagación de E.coli transformada con pGLO
Durante esta práctica no hubo problema alguno durante su desarrollo ya que constaba de unos ajustes en cuanto a los cálculos para hacer el medio de cultivo LB líquido , ya que en lugar de usar los 750 mL solo usamos 100 mL. Lo único que demoró un poco la práctica es que solo una balanza analítica servía y todos lo equipos teníamos que hacer uso de ella.
Nosotros preparamos nuestro medio de cultivo de una manera rápida y eficaz puesto como ya lo mencionamos los cálculos fueron muy sencillos y solo constaba de pesar y mezclar con los 100 mL de agua desionizada, al momento de meter a esterilizar el medio de cultivo dividimos nuestros 100 mL en dos matraces de 125 mL con 50 mL cada uno. Además de esto pusimos agua desionizada a esterilizar junto con todos los medios de cultivo. Y así fue como concluimos satisfactoriamente nuestra práctica y gracias a la ayuda del profesor que de buena manera se ofreció a guardar nuestro medio de cultivo sin tener que, alguien del equipo a esperar a que saliera del autoclave ya que era lo único que nos faltaba para concluir.
Nosotros preparamos nuestro medio de cultivo de una manera rápida y eficaz puesto como ya lo mencionamos los cálculos fueron muy sencillos y solo constaba de pesar y mezclar con los 100 mL de agua desionizada, al momento de meter a esterilizar el medio de cultivo dividimos nuestros 100 mL en dos matraces de 125 mL con 50 mL cada uno. Además de esto pusimos agua desionizada a esterilizar junto con todos los medios de cultivo. Y así fue como concluimos satisfactoriamente nuestra práctica y gracias a la ayuda del profesor que de buena manera se ofreció a guardar nuestro medio de cultivo sin tener que, alguien del equipo a esperar a que saliera del autoclave ya que era lo único que nos faltaba para concluir.
Equipo 3-Prática 5 "Cinética Enzimática"
Durante el desarrollo de esta práctica nos dimos cuenta de que cuando la concentración de sustrato varía la reacción se ve afectada, entre menos concentración es más lenta y entre mayor concentración más rápida.
Al introducir los tubos en el espectro fotómetro pensamos que los valores tenían que resultar de una forma
consecutiva, es decir, ir aumentando hasta que se llegará a un valor en el cual ya no aumentara (valor máximo) y que no disminuyera, pero al momento de realizar las lecturas nos percatamos de que era así y por ende los valores y la gráfica debían de salir correctamente aunado a todos los cálculos posteriores que hicimos.
Sin embargo, en un principio, tuvimos problemas con el espectro fotómetro, ya que el primero que se nos asignó no servía, nos proporcionaron otro para trabajar y había que calibrarlo con el tubo uno, entonces, comenzamos a realizar las lecturas, pero no nos percatamos que teníamos que agitarlo así que al inicio, los valores que obteníamos, salían bajos, luego aumentaban y después disminuían. Dándonos cuenta de esto volvimos a leer la práctica para ver si algo había fallado y nos dimos cuenta de que nos faltaba agitarlo. Después de que los valores nos volvieron a salir mal, vimos si había que calibrarlo de nuevo, y resultó ser que en efecto,que estaba des calibrado, pero durante este el proceso de calibración, una compañera tiró accidental mente parte de la solución y tuvimos que volver a hacerla para calibrarlo, entonces, los valores volvieron a salir como esperábamos.
Al introducir los tubos en el espectro fotómetro pensamos que los valores tenían que resultar de una forma
consecutiva, es decir, ir aumentando hasta que se llegará a un valor en el cual ya no aumentara (valor máximo) y que no disminuyera, pero al momento de realizar las lecturas nos percatamos de que era así y por ende los valores y la gráfica debían de salir correctamente aunado a todos los cálculos posteriores que hicimos.
Sin embargo, en un principio, tuvimos problemas con el espectro fotómetro, ya que el primero que se nos asignó no servía, nos proporcionaron otro para trabajar y había que calibrarlo con el tubo uno, entonces, comenzamos a realizar las lecturas, pero no nos percatamos que teníamos que agitarlo así que al inicio, los valores que obteníamos, salían bajos, luego aumentaban y después disminuían. Dándonos cuenta de esto volvimos a leer la práctica para ver si algo había fallado y nos dimos cuenta de que nos faltaba agitarlo. Después de que los valores nos volvieron a salir mal, vimos si había que calibrarlo de nuevo, y resultó ser que en efecto,que estaba des calibrado, pero durante este el proceso de calibración, una compañera tiró accidental mente parte de la solución y tuvimos que volver a hacerla para calibrarlo, entonces, los valores volvieron a salir como esperábamos.
sábado, 3 de abril de 2010
Equipo 3 "Cuantificación de Proteínas"
Nuestro equipo tuvo el particular problema de la falta de caseína, por diversas razones ya expuestas antes en la práctica anterior, debido a esta situación, no pudimos realizar la primera parte que consistía en preparar la solución de caseína con NaCl y NaOh al 1% y 1 N respectivamente.
Este problema fue grave, pero se resolvió gracias a los compañeros del equipo 1, que nos proporcionó parte de su solución, lo cual cuando medimos en el espectrofotómetro resultó interesante, pues nuestros datos estaban siendo bastante cercanos a lo correcto a diferencia de los compañeros que nos proporcionaron la solución ya que obtenían resultados negativos lo cual era incorrecto y por lo tanto, pensaron que la solución de caseína no había sido preparada adecuadamente, pero, se desecho esta idea cuando observaron nuestros datos, entonces el haber obtenido parte de su solución puede decirse que fue una clase de beneficio mutuo.
En cuanto a la práctica de cuantificación de caseína y el método de Biuret empleado nos dice que el reactivo Biuret forma complejos de color violeta, esto lo comprobamos cuando nuestros diez tubos de ensaye que contenían la caseína comenzaron a tornarse de ese color.
La solución del tubo de ensaye número uno, fue nuestra solución patrón pues contenía albúmina en una concentración que conocíamos y que posteriormente nos permitió obtener los cálculos para la regresión lineal, que como bien se observa fue bastante próxima nuestra curva patrón.
Los resultados de esta práctica puede decirse que fueron satisfactorios comparado a la prática anterior.
Equipo 3 Precipitación Isoeléctrica
Bueno durante la práctica tuvimos problemas ya que nuestro potenciómetro no estaba bien calibrado y tuvimos que hacer uso de otro potenciómetro, además de eso nuestra solución de leche no se precipito lo suficiente como para obtener más caseína. Durante los centrifugados no hubo problema para equilibrar los tubos, a excepción de que una centrifuga se descalibró y eso hizo que perdiéramos tiempo permitiendonos hacer solo 2 centrifugados en la primera sesión, durante los lavados no hubo problemas y en los agitados contábamos con la ayuda del vórtex para unir a la caseína con el solvente.
Bueno durante la práctica tuvimos problemas ya que nuestro potenciómetro no estaba bien calibrado y tuvimos que hacer uso de otro potenciómetro, además de eso nuestra solución de leche no se precipito lo suficiente como para obtener más caseína. Durante los centrifugados no hubo problema para equilibrar los tubos, a excepción de que una centrifuga se descalibró y eso hizo que perdiéramos tiempo permitiendonos hacer solo 2 centrifugados en la primera sesión, durante los lavados no hubo problemas y en los agitados contábamos con la ayuda del vórtex para unir a la caseína con el solvente.
Durante la segunda sesión de esta práctica realizamos el centrifugado que nos faltaba, a pesar de que la centrifuga estaba desbalanceada, el profesor nos prestó otra. Durante el proceso con etanol no hubo problemas, lo único malo es que teníamos una cantidad muy pobre de caseína y nuestro resultado fue ese, una cantidad muy pequeña de caseína después del secado.
Nuestros problemas fueron que en primer lugar no dejamos que se precipitara suficiente, en segundo lugar es que se cayó muestra en diversas ocasiones (por se cayó nos referimos a… “se le cayó al profesor”) de ahí en fuera no hubo problemas en el resto de la práctica pero los resultados no fueron satisfactorios al 100% pero si hubo obtención de caseína lo cual era el punto de la práctica.
miércoles, 31 de marzo de 2010
Introduccion equipo 4: Electroforesis de proteinas
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
La electroforesis es una técnica que se utiliza para analizar y determinar el peso molecular de diferentes tipos de biomoléculas, es muy común utilizarlas en proteínas y ácidos nucleicos.
Fundamentos de la electroforesis
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta es colocada en un campo eléctrico, éstas experimentarán una fuerza de atracción hacia el polo que posea carga opuesta.
Así, si se deja transcurrir un cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo).
El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; por un lado, la fricción con el solvente dificultará este movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento; por otro lado, las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energía cinética propia. Esto se denomina difusión y sigue la llamada ley de Fick. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si la moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel.
El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz molecular que dificulta el movimiento de los solutos.
Consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también. Si ahora aumentamos la intensidad del campo eléctrico, podemos acelerar la migración molecular, pero no por ello variará la difusión y nuestro frente migrará de un modo cada vez más compacto. Así, podemos mejorar la definición del frente aumentando la diferencia de potencial entre los polos y esto estará limitado tan sólo la capacidad de la solución para disipar el calor generado por el paso de la corriente eléctrica. Esto último, debido a que si el calor se acumula se puede hacer hervir a la solución, e incluso descomponer el gel y/o los solutos.
La presencia del gel tiene una consecuencia adicional, ya que aquellas moléculas de mayor tamaño hallarán mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel que aquellas moléculas pequeñas. Por lo tanto, la fricción que se observa durante el movimiento electroforético en un gel depende de la masa y la forma de la molécula, en adición a su carga eléctrica.
Aunque el solvente puede, por si solo, producir una fricción diferente sobre diversas moléculas, su efecto es muy poco apreciable cuando no existe el entramado del gel.
Técnicas
-Electroforesis de zona: las proteínas son moléculas anfóteras: su carga neta depende del pH del medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa. También se puede trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las proteínas precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de variantes de la hemoglobina).
Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel, acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra cuyas proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará más o menos en función de su carga (que también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (+) o cátodo (-) y su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración.
-Isoelectroenfoque: en lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el pI es el pH en el que la carga neta de la proteína es nula, y depende de la composición aminoacídica de la proteína. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de ahí el nombre, isoelectroenfoque).
-Separación por tamaño: permite separar proteinas y ácidos nucléicos. En el caso de las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo; la separación se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más pequeñas corran más que las más grandes.
Aplicaciones
Las proteinas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, y por tanto sus velocidades de migración no son similares entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoelectrico). En estos casos, las proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y un agente reductor como el 2- mercaptoetanol. Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar a través del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación carga/masa similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la proteína en sus sub-unidades. Además, la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migración es proporcional al tamaño y no a su estructura terciaria ni a su interacción con otras macromoléculas. Así, los más grandes se desplazan más lentamente.
Visualización
Una vez separadas las proteínas, deben fijarse y teñirse para poder ser visualizadas. Hay diferentes protocolos en función de lo que se quiere estudiar: fijación por calor o química y tinción en caso de estudios no específicos (proteinograma y electroforesis Hb, por ejemplo) o fijación mediante anticuerpos previa a la tinción en caso de estudiar proteínas específicas (inmunofijación).
Por lo general para la tinción de geles de poliacrilamida se utiliza tinción con plata, tinción de Coomassie o tinción fluorescente. Dependiendo del fin de nuestro análisis. La tinción con plata no es utilizada si se desean hacer análisis por espectrometría de masas (MS) pero es más sensible que la tinción con Azul de Coomassie, por otro lado, la tinción fluorescente es muy sensible y compatible con MS pero los costos de tinción son elevados.
Una tinción sensible y barata es la denominada "Blue Silver" o Coomassie G250. Esta compuesta por azul de Coomassie diluido en una solución coloidal y se utiliza agua destilada para desteñir el gel de poliacrilamida.
Bibliografía:
1. depa.pquim.unam.mx/proteinas/.../EPpage.html
2. http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_proteica
La electroforesis es una técnica que se utiliza para analizar y determinar el peso molecular de diferentes tipos de biomoléculas, es muy común utilizarlas en proteínas y ácidos nucleicos.
Fundamentos de la electroforesis
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta es colocada en un campo eléctrico, éstas experimentarán una fuerza de atracción hacia el polo que posea carga opuesta.
Así, si se deja transcurrir un cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo).
El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; por un lado, la fricción con el solvente dificultará este movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento; por otro lado, las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energía cinética propia. Esto se denomina difusión y sigue la llamada ley de Fick. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si la moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel.
El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz molecular que dificulta el movimiento de los solutos.
Consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también. Si ahora aumentamos la intensidad del campo eléctrico, podemos acelerar la migración molecular, pero no por ello variará la difusión y nuestro frente migrará de un modo cada vez más compacto. Así, podemos mejorar la definición del frente aumentando la diferencia de potencial entre los polos y esto estará limitado tan sólo la capacidad de la solución para disipar el calor generado por el paso de la corriente eléctrica. Esto último, debido a que si el calor se acumula se puede hacer hervir a la solución, e incluso descomponer el gel y/o los solutos.
La presencia del gel tiene una consecuencia adicional, ya que aquellas moléculas de mayor tamaño hallarán mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel que aquellas moléculas pequeñas. Por lo tanto, la fricción que se observa durante el movimiento electroforético en un gel depende de la masa y la forma de la molécula, en adición a su carga eléctrica.
Aunque el solvente puede, por si solo, producir una fricción diferente sobre diversas moléculas, su efecto es muy poco apreciable cuando no existe el entramado del gel.
Técnicas
-Electroforesis de zona: las proteínas son moléculas anfóteras: su carga neta depende del pH del medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa. También se puede trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las proteínas precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de variantes de la hemoglobina).
Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel, acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra cuyas proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará más o menos en función de su carga (que también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (+) o cátodo (-) y su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración.
-Isoelectroenfoque: en lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el pI es el pH en el que la carga neta de la proteína es nula, y depende de la composición aminoacídica de la proteína. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de ahí el nombre, isoelectroenfoque).
-Separación por tamaño: permite separar proteinas y ácidos nucléicos. En el caso de las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo; la separación se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más pequeñas corran más que las más grandes.
Aplicaciones
Las proteinas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, y por tanto sus velocidades de migración no son similares entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoelectrico). En estos casos, las proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y un agente reductor como el 2- mercaptoetanol. Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar a través del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación carga/masa similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la proteína en sus sub-unidades. Además, la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migración es proporcional al tamaño y no a su estructura terciaria ni a su interacción con otras macromoléculas. Así, los más grandes se desplazan más lentamente.
Visualización
Una vez separadas las proteínas, deben fijarse y teñirse para poder ser visualizadas. Hay diferentes protocolos en función de lo que se quiere estudiar: fijación por calor o química y tinción en caso de estudios no específicos (proteinograma y electroforesis Hb, por ejemplo) o fijación mediante anticuerpos previa a la tinción en caso de estudiar proteínas específicas (inmunofijación).
Por lo general para la tinción de geles de poliacrilamida se utiliza tinción con plata, tinción de Coomassie o tinción fluorescente. Dependiendo del fin de nuestro análisis. La tinción con plata no es utilizada si se desean hacer análisis por espectrometría de masas (MS) pero es más sensible que la tinción con Azul de Coomassie, por otro lado, la tinción fluorescente es muy sensible y compatible con MS pero los costos de tinción son elevados.
Una tinción sensible y barata es la denominada "Blue Silver" o Coomassie G250. Esta compuesta por azul de Coomassie diluido en una solución coloidal y se utiliza agua destilada para desteñir el gel de poliacrilamida.
Bibliografía:
1. depa.pquim.unam.mx/proteinas/.../EPpage.html
2. http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_proteica
lunes, 22 de marzo de 2010
Discusion Eq.1 Practica 2
Precipitación isoeléctrica de la Caseína
DISCUSIÓN
Como se puede ver en la Tabla 1, con forme se fue agregando ácido clorhídrico a la solución, se fueron observando cambios en la muestra, desde un líquido blanquecino homogéneo, hasta la precipitación de la caseína en el fondo.
Esto sucede porque al ir bajando el pH, se va haciendo más ácido y así la caseína va llegando a su punto isoeléctrico, que es de 4.8, con lo que se va a separar del resto de la mezcla, precipitando.
Al hacer la purificación de la Caseína en la leche en polvo se obtuvo un porcentaje de rendimiento de 179.84% (llegando a él con los cálculos presentados anteriormente) que es inadecuado pues presenta una gran inconsistencia con el porcentaje esperado.
Esto nos dice que obtuvimos más producto a la cantidad de caseína que teóricamente podíamos obtener, lo que podría significar tres cosas:
1. Que la caseína se duplicó a la hora de hacer la purificación.
2. Que la cantidad real de caseína no es la indicada en la etiqueta.
3. Que no se precipitó únicamente la caseína, si no también otras impurezas como pueden ser lípidos o proteínas con un punto isoeléctrico similar.
La propuesta 1 es poco probable, sino imposible ya que la materia no puede crearse de la nada.
El caso 2 es cierto ya que la cantidad de proteínas indicada en el empaque es únicamente de caseína. Además, al purificar una proteína, el resultado puede variar un poco al que se indica en el empaque. El problema aquí es que en nuestro caso hubo casi por el doble de caseína del que teóricamente se podía obtener, por lo que podríamos descartar esta propuesta, pues aunque sí es cierto que en la etiqueta la cantidad que se proporciona no es exacta, es demasiada la diferencia entre lo que dice y lo que salió en la práctica. El caso número 3 es el más probable ya que el porcentaje fue mucho mayor al obtenido en los cálculos y a simple vista podían apreciarse diferentes fases en el producto, lo que significa que aún quedaron impurezas, como lípidos y proteínas, además de que el método de centrifugación no es el más preciso para la purificación de proteínas.
Además, no se pudo haber obtenido más producto que el teórico porque durante el procedimiento de purificación se fue perdiendo un poco de caseína, ya sea porque no precipitó por completo quedándose en el sobrenadante, o al quitar el sobrenadante nos llevamos un poco de la caseína, y otros problemas de ese estilo, por lo que el porcentaje de rendimiento tenía que ser menor al 100%.
DISCUSIÓN
Como se puede ver en la Tabla 1, con forme se fue agregando ácido clorhídrico a la solución, se fueron observando cambios en la muestra, desde un líquido blanquecino homogéneo, hasta la precipitación de la caseína en el fondo.
Esto sucede porque al ir bajando el pH, se va haciendo más ácido y así la caseína va llegando a su punto isoeléctrico, que es de 4.8, con lo que se va a separar del resto de la mezcla, precipitando.
Al hacer la purificación de la Caseína en la leche en polvo se obtuvo un porcentaje de rendimiento de 179.84% (llegando a él con los cálculos presentados anteriormente) que es inadecuado pues presenta una gran inconsistencia con el porcentaje esperado.
Esto nos dice que obtuvimos más producto a la cantidad de caseína que teóricamente podíamos obtener, lo que podría significar tres cosas:
1. Que la caseína se duplicó a la hora de hacer la purificación.
2. Que la cantidad real de caseína no es la indicada en la etiqueta.
3. Que no se precipitó únicamente la caseína, si no también otras impurezas como pueden ser lípidos o proteínas con un punto isoeléctrico similar.
La propuesta 1 es poco probable, sino imposible ya que la materia no puede crearse de la nada.
El caso 2 es cierto ya que la cantidad de proteínas indicada en el empaque es únicamente de caseína. Además, al purificar una proteína, el resultado puede variar un poco al que se indica en el empaque. El problema aquí es que en nuestro caso hubo casi por el doble de caseína del que teóricamente se podía obtener, por lo que podríamos descartar esta propuesta, pues aunque sí es cierto que en la etiqueta la cantidad que se proporciona no es exacta, es demasiada la diferencia entre lo que dice y lo que salió en la práctica. El caso número 3 es el más probable ya que el porcentaje fue mucho mayor al obtenido en los cálculos y a simple vista podían apreciarse diferentes fases en el producto, lo que significa que aún quedaron impurezas, como lípidos y proteínas, además de que el método de centrifugación no es el más preciso para la purificación de proteínas.
Además, no se pudo haber obtenido más producto que el teórico porque durante el procedimiento de purificación se fue perdiendo un poco de caseína, ya sea porque no precipitó por completo quedándose en el sobrenadante, o al quitar el sobrenadante nos llevamos un poco de la caseína, y otros problemas de ese estilo, por lo que el porcentaje de rendimiento tenía que ser menor al 100%.
miércoles, 10 de marzo de 2010
EQUIPO 3
“CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS”
La albumina está formada por una cadena simple de 585 aminoácidos, En condiciones fisiológicas (pH = 7,40), su punto isoeléctrico está comprendido entre 4,80 y 5,60, es una proteína electronegativa.
La cuantificación de proteínas sirve para determinar la concentración de proteínas en una muestra, se usa comúnmente cuando se realiza una purificación de proteínas (una en específico), esto se realiza para conocer la actividad específica y el diagnóstico de enfermedades
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas:
MÉTODO BIURET:
La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.
A mayor concentración de proteínas, mayor intensidad de color violeta. Estas reacciones, en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas.
-MÉTODO Bradfort
El método Bradford es un muy sensible, sin embargo no todas las proteínas reaccionan igual, muchas tienden a mostrar interferencias. Se basa en la unión de un colorante el cual es una solución ácida de dos colores, azul y naranja y las proteínas se unen a la de color azul.
-MÉTODO DE Ácido Bicinconínico
Este método BCA (abreviatura en inglés) es el más sensible y el que muestra menos interferencias. El BCA es capaz de dar un complejo color púrpura intenso en un medio alcalino, forma la base de un medio analítico capaz de monitorear el ion cuproso producido por la reacción entre las proteínas con Cu+ en un medio alcalino.
-MÉTODO DE Absorción:
Aquí no se pierden las muestras pero intervienen muchos compuestos que absorben en la UV
-MÉTODO DE LOWRY
Involucra la formación de un complejo proteína cobre en solución. Este complejo se reduce lo que promueve que tenga una coloración azul
-MÉTODO ESPECTROFOMÉTRICO
Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz.
Su funcionamiento de basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra. Es lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad Óptica (DO)
· Macarrulla J. (1994). Bioquímica Humana. Segunda Edición. Reverte, Barcelona. España.
· Bohinski, Bioquímica, Haggins, Introducción
· Mertz Edwin T. Bioquímica. Séptima reimpresión. Publicaciones Culturales. México. 1985
domingo, 7 de marzo de 2010
Equipo 2: discusión de la práctica 1
En esta práctica reafirmamos nuestros conocimientos acerca de diferentes formas de expresar concentraciones.
nuestro equipo mal entendio el paso 4 de la solución 1 y disolvió en 25 ml, por separado, cada uno de los 3 reactivos de dicha solución.
lo cual fue erróneo porque el volumen para el cual se hicieron las cálculos en cuestión fue de 30ml, y nostros obtuvimos alrededor de 100ml de volumen final.
Repetimos el paso hasta obtener lo correcto; Nos costó trabajo obtener el pH de 8, pero en el segundo intento la obtuvimos sin tener que recurrir al Hidróxido de Sodio (NaOH).
nuestro equipo mal entendio el paso 4 de la solución 1 y disolvió en 25 ml, por separado, cada uno de los 3 reactivos de dicha solución.
lo cual fue erróneo porque el volumen para el cual se hicieron las cálculos en cuestión fue de 30ml, y nostros obtuvimos alrededor de 100ml de volumen final.
Repetimos el paso hasta obtener lo correcto; Nos costó trabajo obtener el pH de 8, pero en el segundo intento la obtuvimos sin tener que recurrir al Hidróxido de Sodio (NaOH).
domingo, 28 de febrero de 2010
Equipo 3 Práctica 1 "Disoluciones"
En esta práctica hicimos uso de cálculos de concentración de soluciones, cosa que ya no dominamos adecuadamente porque tenemos diferentes métodos para realizarlos pero la mayoría de nuestros cálculos fueron correctos y los que no fueron explicados por el profesor.
Durante la preparación de las soluciones no hubo dificultades a excepción del amortiguador de fosfato de sodio ya que teníamos que ajustar su pH usando una solución alcalina con gran precisión, además de que se formó una especie de “piedra” difícil de disolver y no contábamos con el material necesario para hacer el calculo del volumen de esta solución y tuvimos que realizarla en dos partes.
De ahí en fuera no hubo ningún problema para realizar las otras soluciones y se obtuvierón los resultados deseados en esta práctica.
Discusión Pract. 1 Eq. 1
La práctica de disoluciones concluyó muy bien ya que se cumplieron los objetivos. El objetivo principal de la práctica fue realizar los cálculos químicos de concentración de soluciones que más se utilizan en el laboratorio de biología molecular, y a partir de ahí preparar correctamente las soluciones, manejando a su vez adecuadamente el material volumétrico, así como el potenciómetro. El procedimiento se llevó a cabo de manera precisa y determinó el buen resultado de la práctica pues los resultados salieron como se esperó en volumen, pH y concentración.
sábado, 27 de febrero de 2010
PRÁCTICA 2: PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA DE LA LECHE
¿CÓMO AISLAR UNA PROTEÍNA?
En una célula hay muchas proteínas, para poder estudiarlas, es necesario contar con una muestra homogénea que sólo contenga moléculas de un mismo tipo.
En general las técnicas de separación se basan en:
• El tamaño
• La carga
• La polaridad
Mientras más simple sea la composición de la proteína en cuestión, y más enriquecida este en la célula, mayores son las posibilidades de éxito de la purificación.
El primer paso implica la ruptura de las células. Esto puede efectuarse con diversas técnicas. El más sencillo es moler el tejido en una licuadora con un amortiguador apropiado. Las células se rompen y liberan proteínas solubles. El proceso también rompe muchos orgánulos celulares.
El segundo paso corresponde al método de purificación, que dependerá de la característica tomada en cuenta. Ejemplos de algunas técnicas de purificación:
• Cromatografía liquida de intercambio iónico.
• Cromatografía liquida por filtración en geles.
• Separación por geles de poliacrilaminada en presencia de detergentes.
• Electroenfoque en geles de poliacrilamida.
• Cromatografía liquida por afinidad.
• Ultrafiltración utilizando filtros y/o matrices sintéticas.
• Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).
• Precipitación selectiva.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA CASEÍNA
La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche.
Las moléculas individuales de caseína se caracterizan en general por tener un tamaño mediano (200 aminoácidos), contar con un número alto de residuos de prolina que cusa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro.
La falta de organización de las moléculas de caseína ha hecho que hasta el momento ninguna haya podido cristalizarse para llevar a cabo estudios detallados de su estructura secundaria y terciaria.
Una propiedad clásica, que ha servido durante un siglo para su definición operacional, es que las caseínas precipitan a pH de 4.6.
PUNTO ISOELÉCTRICO
Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían protonados (-NH3+).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.
Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación /desprotonación de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están formadas por multitud de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminoácidos que la componen (anexo I) y del pH del medio.
PRECIPITACIÓN POR PUNTO ISOELÉCTRICO
Precipitación por punto isoeléctrico (IEF, siglas en inglés) es un método electroforético para la separación de proteínas, de acuerdo a su punto isoeléctrico, en un gradiente de pH estable. El método consta de una capa de soporte (usualmente un gel de poliacrilamida, pero también puede usarse agarosa) que contiene una mezcla de anfolitos (ácidos polyamino-plicarboxílico sintéticos).
Cuando un campo eléctrico es aplicado al gel, los anfolitos se auto ordenan de acuerdo a su punto isoeléctrico desde el ánodo hasta el cátodo. Cada anfolito mantiene un pH local correspondiente con su punto isoeléctrico y este pH uniforme se expresa en capas en el gel. Si una proteína es depositada en un extremo del gel, esta migrará bajo la influencia del campo eléctrico hasta que encuentre la región de pH que le corresponde a su punto isoeléctrico. A este punto la proteína tendrá carga neta y quedará “estacionada” en ese lugar.
En esta técnica las proteínas son separadas de acuerdo a su carga.
En una célula hay muchas proteínas, para poder estudiarlas, es necesario contar con una muestra homogénea que sólo contenga moléculas de un mismo tipo.
En general las técnicas de separación se basan en:
• El tamaño
• La carga
• La polaridad
Mientras más simple sea la composición de la proteína en cuestión, y más enriquecida este en la célula, mayores son las posibilidades de éxito de la purificación.
El primer paso implica la ruptura de las células. Esto puede efectuarse con diversas técnicas. El más sencillo es moler el tejido en una licuadora con un amortiguador apropiado. Las células se rompen y liberan proteínas solubles. El proceso también rompe muchos orgánulos celulares.
El segundo paso corresponde al método de purificación, que dependerá de la característica tomada en cuenta. Ejemplos de algunas técnicas de purificación:
• Cromatografía liquida de intercambio iónico.
• Cromatografía liquida por filtración en geles.
• Separación por geles de poliacrilaminada en presencia de detergentes.
• Electroenfoque en geles de poliacrilamida.
• Cromatografía liquida por afinidad.
• Ultrafiltración utilizando filtros y/o matrices sintéticas.
• Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).
• Precipitación selectiva.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA CASEÍNA
La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche.
Las moléculas individuales de caseína se caracterizan en general por tener un tamaño mediano (200 aminoácidos), contar con un número alto de residuos de prolina que cusa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro.
La falta de organización de las moléculas de caseína ha hecho que hasta el momento ninguna haya podido cristalizarse para llevar a cabo estudios detallados de su estructura secundaria y terciaria.
Una propiedad clásica, que ha servido durante un siglo para su definición operacional, es que las caseínas precipitan a pH de 4.6.
PUNTO ISOELÉCTRICO
Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían protonados (-NH3+).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.
Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación /desprotonación de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están formadas por multitud de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminoácidos que la componen (anexo I) y del pH del medio.
PRECIPITACIÓN POR PUNTO ISOELÉCTRICO
Precipitación por punto isoeléctrico (IEF, siglas en inglés) es un método electroforético para la separación de proteínas, de acuerdo a su punto isoeléctrico, en un gradiente de pH estable. El método consta de una capa de soporte (usualmente un gel de poliacrilamida, pero también puede usarse agarosa) que contiene una mezcla de anfolitos (ácidos polyamino-plicarboxílico sintéticos).
Cuando un campo eléctrico es aplicado al gel, los anfolitos se auto ordenan de acuerdo a su punto isoeléctrico desde el ánodo hasta el cátodo. Cada anfolito mantiene un pH local correspondiente con su punto isoeléctrico y este pH uniforme se expresa en capas en el gel. Si una proteína es depositada en un extremo del gel, esta migrará bajo la influencia del campo eléctrico hasta que encuentre la región de pH que le corresponde a su punto isoeléctrico. A este punto la proteína tendrá carga neta y quedará “estacionada” en ese lugar.
En esta técnica las proteínas son separadas de acuerdo a su carga.
sábado, 20 de febrero de 2010
Introducción práctica 1 Disoluciones (Eq 1)
Las disoluciones son mezclas homogéneas de dos o más componentes. Pueden ser gaseosas, líquidas o sólidas. Una disolución acuosa resulta cuando un compuesto iónico es disuelto en agua. La sustancia que se disuelve es el soluto y el agua es el disolvente. La cantidad de soluto que se disuelve en un volumen o una cantidad dada de disolución se conoce como concentración. La concentración de una disolución se puede expresar de las siguientes formas.
Porciento masa en masa (% m/m): La cantidad en gramos de soluto por cada 100 gramos de disolución.
P. ej., una disolución al 10 % m/m de NaOH contiene 10 g de NaOH por 100 g de disolución.
Fórmula: %mm= masa soluto / masa disolvente x 100
Porciento volumen en volumen (% v/v): El volumen en mililitros de soluto por cada 100 mililitros de disolución.
P. ej., una disolución al 25 % v/v de alcohol en agua, contiene 25 mL de alcohol por 100 mL de disolución.
Fórmula: %vv= vol soluto / vol disolvente x 100
Porciento masa en volumen (% m/v): La cantidad en gramos de soluto por cada 100 mililitros de disolución.
P. ej., una disolución al 5 % m/v de KCl, contiene 5 g de KCl por 100 mL de disolución.
Fórmula: %mv= masa soluto / vol disolvente x 100
Partes por millón (ppm): Las partes de soluto por cada 106 (un millón) partes de disolución. Una parte por millón representa la cantidad en mg de soluto por cada litro de disolución.
Fórmula: ppm= masa soluto / masa disolvente x un millon
Densidad (d) La cantidad en gramos de disolución por cada mL de disolución. Unidades comunes: g/mL o g/cm3.
Fórmula: masa / volumen
Molaridad (M): El número de moles de soluto por litro de disolución.
P. ej., una disolución al 0.1 M HCl contiene 0.1 moles de HCl por 1 L de disolución.
Fórmula: M= masa / (Masa Molar x Volumen(L))
Normalidad (N): El número de equivalentes de soluto por litro de disolución.
C = número de especies químicas que participan en una reacción.
P. ej., una disolución al 0.5 N NaOH contiene 0.5 equivalentes de NaOH por 1 L de disolución.
C = especies químicas en el compuesto
Fórmula: N= #eq / volumen de la solución
#eq= gr de soluto / C
Valores p: Para una sustancia X en disolución, su valor p se define como el logaritmo negativo de su concentración molar.
P. ej., para el ion H+ en disolución, pH = -log[H]. Si la especie es una sustancia como NaCl, pNaCl = -log[NaCl].
Fórmula: pX= -log [X]; pH= - log [H]; pOH= - log [OH]
Porciento masa en masa (% m/m): La cantidad en gramos de soluto por cada 100 gramos de disolución.
P. ej., una disolución al 10 % m/m de NaOH contiene 10 g de NaOH por 100 g de disolución.
Fórmula: %mm= masa soluto / masa disolvente x 100
Porciento volumen en volumen (% v/v): El volumen en mililitros de soluto por cada 100 mililitros de disolución.
P. ej., una disolución al 25 % v/v de alcohol en agua, contiene 25 mL de alcohol por 100 mL de disolución.
Fórmula: %vv= vol soluto / vol disolvente x 100
Porciento masa en volumen (% m/v): La cantidad en gramos de soluto por cada 100 mililitros de disolución.
P. ej., una disolución al 5 % m/v de KCl, contiene 5 g de KCl por 100 mL de disolución.
Fórmula: %mv= masa soluto / vol disolvente x 100
Partes por millón (ppm): Las partes de soluto por cada 106 (un millón) partes de disolución. Una parte por millón representa la cantidad en mg de soluto por cada litro de disolución.
Fórmula: ppm= masa soluto / masa disolvente x un millon
Densidad (d) La cantidad en gramos de disolución por cada mL de disolución. Unidades comunes: g/mL o g/cm3.
Fórmula: masa / volumen
Molaridad (M): El número de moles de soluto por litro de disolución.
P. ej., una disolución al 0.1 M HCl contiene 0.1 moles de HCl por 1 L de disolución.
Fórmula: M= masa / (Masa Molar x Volumen(L))
Normalidad (N): El número de equivalentes de soluto por litro de disolución.
C = número de especies químicas que participan en una reacción.
P. ej., una disolución al 0.5 N NaOH contiene 0.5 equivalentes de NaOH por 1 L de disolución.
C = especies químicas en el compuesto
Fórmula: N= #eq / volumen de la solución
#eq= gr de soluto / C
Valores p: Para una sustancia X en disolución, su valor p se define como el logaritmo negativo de su concentración molar.
P. ej., para el ion H+ en disolución, pH = -log[H]. Si la especie es una sustancia como NaCl, pNaCl = -log[NaCl].
Fórmula: pX= -log [X]; pH= - log [H]; pOH= - log [OH]
lunes, 15 de febrero de 2010
Laboratorio de Biologìa Molecular de la Cèlula I grupo 5044.
Hola a todos este espacio creado es con la finalidad de que podamos interactuar realizando comentarios o discusiones de las sesiones experimentales que estaremos realizando a lo largo del semestre. Cada equipo serà el encargado de incorporar informaciòn de las actividades experimentales y serà responsabilidad de todos los equipos realizar comentarios u observaciones una vez concluìda o finalizada la pràctica correspondiente. Para incorporar su investigaciòn en la barra de herramientas en la parte superior debe decir acceder o nueva entrada; si dice acceder tienen que ingresar con su cuenta de correo de gmail que crearon y dar su contraseña particular, y si ya dice nueva entrada listo podran ingresar de manera directa. Espero que sea de ayuda y podamos sacar provechoa a esta actividad por su atenciòn y participaciòn gracias y estamos en contacto.
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