Introduccion equipo 4: Electroforesis de proteinas

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

La electroforesis es una técnica que se utiliza para analizar y determinar el peso molecular de diferentes tipos de biomoléculas, es muy común utilizarlas en proteínas y ácidos nucleicos.

Fundamentos de la electroforesis

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta es colocada en un campo eléctrico, éstas experimentarán una fuerza de atracción hacia el polo que posea carga opuesta.

Así, si se deja transcurrir un cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo).

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; por un lado, la fricción con el solvente dificultará este movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento; por otro lado, las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energía cinética propia. Esto se denomina difusión y sigue la llamada ley de Fick. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.

La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si la moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel.
El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz molecular que dificulta el movimiento de los solutos.

Consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también. Si ahora aumentamos la intensidad del campo eléctrico, podemos acelerar la migración molecular, pero no por ello variará la difusión y nuestro frente migrará de un modo cada vez más compacto. Así, podemos mejorar la definición del frente aumentando la diferencia de potencial entre los polos y esto estará limitado tan sólo la capacidad de la solución para disipar el calor generado por el paso de la corriente eléctrica. Esto último, debido a que si el calor se acumula se puede hacer hervir a la solución, e incluso descomponer el gel y/o los solutos.

La presencia del gel tiene una consecuencia adicional, ya que aquellas moléculas de mayor tamaño hallarán mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel que aquellas moléculas pequeñas. Por lo tanto, la fricción que se observa durante el movimiento electroforético en un gel depende de la masa y la forma de la molécula, en adición a su carga eléctrica.
Aunque el solvente puede, por si solo, producir una fricción diferente sobre diversas moléculas, su efecto es muy poco apreciable cuando no existe el entramado del gel.

Técnicas

-Electroforesis de zona: las proteínas son moléculas anfóteras: su carga neta depende del pH del medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa. También se puede trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las proteínas precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de variantes de la hemoglobina).
Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel, acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra cuyas proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará más o menos en función de su carga (que también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (+) o cátodo (-) y su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración.

-Isoelectroenfoque: en lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el pI es el pH en el que la carga neta de la proteína es nula, y depende de la composición aminoacídica de la proteína. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de ahí el nombre, isoelectroenfoque).

-Separación por tamaño: permite separar proteinas y ácidos nucléicos. En el caso de las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo; la separación se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más pequeñas corran más que las más grandes.

Aplicaciones

Las proteinas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, y por tanto sus velocidades de migración no son similares entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoelectrico). En estos casos, las proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y un agente reductor como el 2- mercaptoetanol. Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar a través del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación carga/masa similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la proteína en sus sub-unidades. Además, la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migración es proporcional al tamaño y no a su estructura terciaria ni a su interacción con otras macromoléculas. Así, los más grandes se desplazan más lentamente.

Visualización

Una vez separadas las proteínas, deben fijarse y teñirse para poder ser visualizadas. Hay diferentes protocolos en función de lo que se quiere estudiar: fijación por calor o química y tinción en caso de estudios no específicos (proteinograma y electroforesis Hb, por ejemplo) o fijación mediante anticuerpos previa a la tinción en caso de estudiar proteínas específicas (inmunofijación).
Por lo general para la tinción de geles de poliacrilamida se utiliza tinción con plata, tinción de Coomassie o tinción fluorescente. Dependiendo del fin de nuestro análisis. La tinción con plata no es utilizada si se desean hacer análisis por espectrometría de masas (MS) pero es más sensible que la tinción con Azul de Coomassie, por otro lado, la tinción fluorescente es muy sensible y compatible con MS pero los costos de tinción son elevados.
Una tinción sensible y barata es la denominada "Blue Silver" o Coomassie G250. Esta compuesta por azul de Coomassie diluido en una solución coloidal y se utiliza agua destilada para desteñir el gel de poliacrilamida.

Bibliografía:
1. depa.pquim.unam.mx/proteinas/.../EPpage.html
2. http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_proteica