EQUIPO 3

“CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS”

La albúmina, que revisaremos dentro de la práctica, es una proteína que se encuentra en la sangre, entre sus funciones tenemos: el transporte de los ácidos grasos, bilirrubina, calcio y aldosterona; regulación de la presión osmótica plasmática frente a los líquidos intersticiales.

La albumina está formada por una cadena simple de 585 aminoácidos, En condiciones fisiológicas (pH = 7,40), su punto isoeléctrico está comprendido entre 4,80 y 5,60, es una proteína electronegativa.

La cuantificación de proteínas sirve para determinar la concentración de proteínas en una muestra, se usa comúnmente cuando se realiza una purificación de proteínas (una en específico), esto se realiza para conocer la actividad específica y el diagnóstico de enfermedades

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas:

MÉTODO BIURET:

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO₄ en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu²⁺ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H₂N-CO-NH-CO-NH₂), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.

A mayor concentración de proteínas, mayor intensidad de color violeta. Estas reacciones, en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas.

-MÉTODO Bradfort

El método Bradford es un muy sensible, sin embargo no todas las proteínas reaccionan igual, muchas tienden a mostrar interferencias. Se basa en la unión de un colorante el cual es una solución ácida de dos colores, azul y naranja y las proteínas se unen a la de color azul.

-MÉTODO DE Ácido Bicinconínico

Este método BCA (abreviatura en inglés) es el más sensible y el que muestra menos interferencias. El BCA es capaz de dar un complejo color púrpura intenso en un medio alcalino, forma la base de un medio analítico capaz de monitorear el ion cuproso producido por la reacción entre las proteínas con Cu+ en un medio alcalino.

-MÉTODO DE Absorción:

Aquí no se pierden las muestras pero intervienen muchos compuestos que absorben en la UV

-MÉTODO DE LOWRY

Involucra la formación de un complejo proteína cobre en solución. Este complejo se reduce lo que promueve que tenga una coloración azul

-MÉTODO ESPECTROFOMÉTRICO

Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).

La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una  específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz.

Su funcionamiento de basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la luz incidente (I₀) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra. Es lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad Óptica (DO)

· Macarrulla J. (1994). Bioquímica Humana. Segunda Edición. Reverte, Barcelona. España.

· Bohinski, Bioquímica, Haggins, Introducción

· Mertz Edwin T. Bioquímica. Séptima reimpresión. Publicaciones Culturales. México. 1985