Introduccion equipo 4: Electroforesis de proteinas

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

La electroforesis es una técnica que se utiliza para analizar y determinar el peso molecular de diferentes tipos de biomoléculas, es muy común utilizarlas en proteínas y ácidos nucleicos.

Fundamentos de la electroforesis

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta es colocada en un campo eléctrico, éstas experimentarán una fuerza de atracción hacia el polo que posea carga opuesta.

Así, si se deja transcurrir un cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo).

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; por un lado, la fricción con el solvente dificultará este movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento; por otro lado, las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energía cinética propia. Esto se denomina difusión y sigue la llamada ley de Fick. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.

La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si la moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel.
El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz molecular que dificulta el movimiento de los solutos.

Consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también. Si ahora aumentamos la intensidad del campo eléctrico, podemos acelerar la migración molecular, pero no por ello variará la difusión y nuestro frente migrará de un modo cada vez más compacto. Así, podemos mejorar la definición del frente aumentando la diferencia de potencial entre los polos y esto estará limitado tan sólo la capacidad de la solución para disipar el calor generado por el paso de la corriente eléctrica. Esto último, debido a que si el calor se acumula se puede hacer hervir a la solución, e incluso descomponer el gel y/o los solutos.

La presencia del gel tiene una consecuencia adicional, ya que aquellas moléculas de mayor tamaño hallarán mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel que aquellas moléculas pequeñas. Por lo tanto, la fricción que se observa durante el movimiento electroforético en un gel depende de la masa y la forma de la molécula, en adición a su carga eléctrica.
Aunque el solvente puede, por si solo, producir una fricción diferente sobre diversas moléculas, su efecto es muy poco apreciable cuando no existe el entramado del gel.

Técnicas

-Electroforesis de zona: las proteínas son moléculas anfóteras: su carga neta depende del pH del medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa. También se puede trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las proteínas precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de variantes de la hemoglobina).
Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel, acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra cuyas proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará más o menos en función de su carga (que también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (+) o cátodo (-) y su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración.

-Isoelectroenfoque: en lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el pI es el pH en el que la carga neta de la proteína es nula, y depende de la composición aminoacídica de la proteína. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de ahí el nombre, isoelectroenfoque).

-Separación por tamaño: permite separar proteinas y ácidos nucléicos. En el caso de las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo; la separación se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más pequeñas corran más que las más grandes.

Aplicaciones

Las proteinas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, y por tanto sus velocidades de migración no son similares entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoelectrico). En estos casos, las proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y un agente reductor como el 2- mercaptoetanol. Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar a través del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación carga/masa similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la proteína en sus sub-unidades. Además, la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migración es proporcional al tamaño y no a su estructura terciaria ni a su interacción con otras macromoléculas. Así, los más grandes se desplazan más lentamente.

Visualización

Una vez separadas las proteínas, deben fijarse y teñirse para poder ser visualizadas. Hay diferentes protocolos en función de lo que se quiere estudiar: fijación por calor o química y tinción en caso de estudios no específicos (proteinograma y electroforesis Hb, por ejemplo) o fijación mediante anticuerpos previa a la tinción en caso de estudiar proteínas específicas (inmunofijación).
Por lo general para la tinción de geles de poliacrilamida se utiliza tinción con plata, tinción de Coomassie o tinción fluorescente. Dependiendo del fin de nuestro análisis. La tinción con plata no es utilizada si se desean hacer análisis por espectrometría de masas (MS) pero es más sensible que la tinción con Azul de Coomassie, por otro lado, la tinción fluorescente es muy sensible y compatible con MS pero los costos de tinción son elevados.
Una tinción sensible y barata es la denominada "Blue Silver" o Coomassie G250. Esta compuesta por azul de Coomassie diluido en una solución coloidal y se utiliza agua destilada para desteñir el gel de poliacrilamida.

Bibliografía:
1. depa.pquim.unam.mx/proteinas/.../EPpage.html
2. http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_proteica

Discusion Eq.1 Practica 2

Precipitación isoeléctrica de la Caseína
DISCUSIÓN
Como se puede ver en la Tabla 1, con forme se fue agregando ácido clorhídrico a la solución, se fueron observando cambios en la muestra, desde un líquido blanquecino homogéneo, hasta la precipitación de la caseína en el fondo.
Esto sucede porque al ir bajando el pH, se va haciendo más ácido y así la caseína va llegando a su punto isoeléctrico, que es de 4.8, con lo que se va a separar del resto de la mezcla, precipitando.
Al hacer la purificación de la Caseína en la leche en polvo se obtuvo un porcentaje de rendimiento de 179.84% (llegando a él con los cálculos presentados anteriormente) que es inadecuado pues presenta una gran inconsistencia con el porcentaje esperado.
Esto nos dice que obtuvimos más producto a la cantidad de caseína que teóricamente podíamos obtener, lo que podría significar tres cosas:
1. Que la caseína se duplicó a la hora de hacer la purificación.
2. Que la cantidad real de caseína no es la indicada en la etiqueta.
3. Que no se precipitó únicamente la caseína, si no también otras impurezas como pueden ser lípidos o proteínas con un punto isoeléctrico similar.

La propuesta 1 es poco probable, sino imposible ya que la materia no puede crearse de la nada.
El caso 2 es cierto ya que la cantidad de proteínas indicada en el empaque es únicamente de caseína. Además, al purificar una proteína, el resultado puede variar un poco al que se indica en el empaque. El problema aquí es que en nuestro caso hubo casi por el doble de caseína del que teóricamente se podía obtener, por lo que podríamos descartar esta propuesta, pues aunque sí es cierto que en la etiqueta la cantidad que se proporciona no es exacta, es demasiada la diferencia entre lo que dice y lo que salió en la práctica. El caso número 3 es el más probable ya que el porcentaje fue mucho mayor al obtenido en los cálculos y a simple vista podían apreciarse diferentes fases en el producto, lo que significa que aún quedaron impurezas, como lípidos y proteínas, además de que el método de centrifugación no es el más preciso para la purificación de proteínas.
Además, no se pudo haber obtenido más producto que el teórico porque durante el procedimiento de purificación se fue perdiendo un poco de caseína, ya sea porque no precipitó por completo quedándose en el sobrenadante, o al quitar el sobrenadante nos llevamos un poco de la caseína, y otros problemas de ese estilo, por lo que el porcentaje de rendimiento tenía que ser menor al 100%.

EQUIPO 3

“CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS”

La albúmina, que revisaremos dentro de la práctica, es una proteína que se encuentra en la sangre, entre sus funciones tenemos: el transporte de los ácidos grasos, bilirrubina, calcio y aldosterona; regulación de la presión osmótica plasmática frente a los líquidos intersticiales.

La albumina está formada por una cadena simple de 585 aminoácidos, En condiciones fisiológicas (pH = 7,40), su punto isoeléctrico está comprendido entre 4,80 y 5,60, es una proteína electronegativa.

La cuantificación de proteínas sirve para determinar la concentración de proteínas en una muestra, se usa comúnmente cuando se realiza una purificación de proteínas (una en específico), esto se realiza para conocer la actividad específica y el diagnóstico de enfermedades

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas:

MÉTODO BIURET:

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO₄ en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu²⁺ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H₂N-CO-NH-CO-NH₂), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.

A mayor concentración de proteínas, mayor intensidad de color violeta. Estas reacciones, en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas.

-MÉTODO Bradfort

El método Bradford es un muy sensible, sin embargo no todas las proteínas reaccionan igual, muchas tienden a mostrar interferencias. Se basa en la unión de un colorante el cual es una solución ácida de dos colores, azul y naranja y las proteínas se unen a la de color azul.

-MÉTODO DE Ácido Bicinconínico

Este método BCA (abreviatura en inglés) es el más sensible y el que muestra menos interferencias. El BCA es capaz de dar un complejo color púrpura intenso en un medio alcalino, forma la base de un medio analítico capaz de monitorear el ion cuproso producido por la reacción entre las proteínas con Cu+ en un medio alcalino.

-MÉTODO DE Absorción:

Aquí no se pierden las muestras pero intervienen muchos compuestos que absorben en la UV

-MÉTODO DE LOWRY

Involucra la formación de un complejo proteína cobre en solución. Este complejo se reduce lo que promueve que tenga una coloración azul

-MÉTODO ESPECTROFOMÉTRICO

Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).

La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una  específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz.

Su funcionamiento de basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la luz incidente (I₀) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra. Es lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad Óptica (DO)

· Macarrulla J. (1994). Bioquímica Humana. Segunda Edición. Reverte, Barcelona. España.

· Bohinski, Bioquímica, Haggins, Introducción

· Mertz Edwin T. Bioquímica. Séptima reimpresión. Publicaciones Culturales. México. 1985

Equipo 2: discusión de la práctica 1

En esta práctica reafirmamos nuestros conocimientos acerca de diferentes formas de expresar concentraciones.
nuestro equipo mal entendio el paso 4 de la solución 1 y disolvió en 25 ml, por separado, cada uno de los 3 reactivos de dicha solución.
lo cual fue erróneo porque el volumen para el cual se hicieron las cálculos en cuestión fue de 30ml, y nostros obtuvimos alrededor de 100ml de volumen final.
Repetimos el paso hasta obtener lo correcto; Nos costó trabajo obtener el pH de 8, pero en el segundo intento la obtuvimos sin tener que recurrir al Hidróxido de Sodio (NaOH).