PRÁCTICA 2: PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA DE LA LECHE

¿CÓMO AISLAR UNA PROTEÍNA?

En una célula hay muchas proteínas, para poder estudiarlas, es necesario contar con una muestra homogénea que sólo contenga moléculas de un mismo tipo.
En general las técnicas de separación se basan en:
• El tamaño
• La carga
• La polaridad
Mientras más simple sea la composición de la proteína en cuestión, y más enriquecida este en la célula, mayores son las posibilidades de éxito de la purificación.

El primer paso implica la ruptura de las células. Esto puede efectuarse con diversas técnicas. El más sencillo es moler el tejido en una licuadora con un amortiguador apropiado. Las células se rompen y liberan proteínas solubles. El proceso también rompe muchos orgánulos celulares.

El segundo paso corresponde al método de purificación, que dependerá de la característica tomada en cuenta. Ejemplos de algunas técnicas de purificación:

• Cromatografía liquida de intercambio iónico.
• Cromatografía liquida por filtración en geles.
• Separación por geles de poliacrilaminada en presencia de detergentes.
• Electroenfoque en geles de poliacrilamida.
• Cromatografía liquida por afinidad.
• Ultrafiltración utilizando filtros y/o matrices sintéticas.
• Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).
• Precipitación selectiva.


CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA CASEÍNA

La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche.
Las moléculas individuales de caseína se caracterizan en general por tener un tamaño mediano (200 aminoácidos), contar con un número alto de residuos de prolina que cusa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro.
La falta de organización de las moléculas de caseína ha hecho que hasta el momento ninguna haya podido cristalizarse para llevar a cabo estudios detallados de su estructura secundaria y terciaria.

Una propiedad clásica, que ha servido durante un siglo para su definición operacional, es que las caseínas precipitan a pH de 4.6.



PUNTO ISOELÉCTRICO

Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían protonados (-NH3+).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.
Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación /desprotonación de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están formadas por multitud de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminoácidos que la componen (anexo I) y del pH del medio.


PRECIPITACIÓN POR PUNTO ISOELÉCTRICO

Precipitación por punto isoeléctrico (IEF, siglas en inglés) es un método electroforético para la separación de proteínas, de acuerdo a su punto isoeléctrico, en un gradiente de pH estable. El método consta de una capa de soporte (usualmente un gel de poliacrilamida, pero también puede usarse agarosa) que contiene una mezcla de anfolitos (ácidos polyamino-plicarboxílico sintéticos).
Cuando un campo eléctrico es aplicado al gel, los anfolitos se auto ordenan de acuerdo a su punto isoeléctrico desde el ánodo hasta el cátodo. Cada anfolito mantiene un pH local correspondiente con su punto isoeléctrico y este pH uniforme se expresa en capas en el gel. Si una proteína es depositada en un extremo del gel, esta migrará bajo la influencia del campo eléctrico hasta que encuentre la región de pH que le corresponde a su punto isoeléctrico. A este punto la proteína tendrá carga neta y quedará “estacionada” en ese lugar.
En esta técnica las proteínas son separadas de acuerdo a su carga.