Equipo 2. Introducción de práctia 6 minipreparaciones de plásmido PGLO

¿QUÉ ES UN PLÁSMIDO?

Son pequeñas moléculas del DNA extracromosómico que aparecen en el citoplasma y que aportan solamente unos genes; se pueden llamar como plásmidos ó episomas según con la relación genética con el DNA cromosómico. La mayoría de las células contiene de 1 a 20 moléculas de plásmidos, estos se parecen en tamaño a los DNAs virales, están comprendidos entre 5 y100 megadaltones, se replican en números fijos junto con los cromosomas, los llamados episomas se incorporan al cromosoma de la célula huésped. Los plásmidos pueden ser transferidos de una célula bacteriana a otra durante la conjugación sexuada, confiriendo así nuevas características fenotípicas a la célula recipiendaria. Las bacterias, a diferencia de las células eucariotas (por ejemplo las que forman nuestro cuerpo) a parte de su ADN genómico heredado o cromosoma bacteriano, poseen otro tipo de ADN que "se lo pasan" de unas a otras. Es lo que se llama la herencia o transferencia horizontal. Una bacteria se encuenentra a otra y es capaz de pasarle de forma fisiológica y controlada una copia de ese ADN. Pues bien esos ADN son los "plásmidos". Son trozos de ADN circulares y cerrados covalentemente (ccc) y les sirven porque gracias a ellos adquieren algún caracter fenótípico nuevo, por ejemplo, resistencia a la ampicilina.
Pues bien, la utilización de estos plásmidos en los laboratorios ha representado uno de los mayores avances en la ciencia de los últimos 40 años.
Si se toma ese plásmido, se abre por un sitio para dejarlo lineal y a eso le unes un trozo de ADN o un gen (que a tí te interesa investigar)y posteriormente lo cierras de nuevo para dejarlo circular, hemos conseguido vectorizar ese trozo de ADN que nos interesa y ahora somos capaces de "meterlo" dentro de la bacteria reconociendolo como suyo. De otra forma, la bacteria rompería el ADN sin vectorizar.



¿QUÉ ES UN VECTOR DE CLONACIÓN?

LOS PLÁSMIDOS Y EL FAGO LAMBDA SON VECTORES DE ELECCIÓN PARA EL CLONADO DE DNA EN LAS BACTERIAS.

Uno de los plásmidos más útiles para el clonado es pBR322, que contiene genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina (un antibiótico análogo a la penicilina). Este plásmido contiene una serie de lugares concretos que pueden ser atacados por endonucleasas específicas para luego introducir fragmentos de DNA. La inserción de DNA en el punto de restricción de la EcoRI no altera ninguno de los dos genes de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, la inserción en los puntos de restricción de las HindIII. SalI o BamHI inactiva el gen de resistencia a la tetraciclina, un efecto que se denomina inactivación insercional. Las células que contienen el pBR322 con un DNA insertado son resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, y así pueden seleccionarse fácilmente. Las células que no consiguieron captar el vector son sensibles a los dos antibióticos, mientras que las que captaron el pBR322 sin DNA insertados son resistentes en ambos.
El fago lambda (ג) en otro vector ampliamente utilizado. Este bacteriófago puede disfrutar de do estilos de vida distintos: puede destruir a su hospedador, o bien puede pasar a formar parte de él. En el ciclo lítico las funciones víricas aparecen plenamente expresadas: el DNA y las proteínas víricas se producen rápidamente y se empaquetan en forma de partículas víricas, que llevan a la lisis (destrucción) de la célula hospedadora, y a la brusca aparición de una progenie de unas 100 partículas víricas o virones. En la ciclo lisogénico, el DNA del fago resulta integrado en el genoma de la célula que lo alberga y puede replicarse junto con el DNA de esta célula durante muchas generaciones permaneciendo inactivo. Ciertos cambios ambientales pueden desencadenar la expresión de este DNA vírico durmiente, con lo que tiene lugar la formación de progenie vírica y se desencadena la lisis del hospedador, Largas secuencias del DNA de 48 kb del fago ג no son esenciales para la infección lítica, y pueden ser remplazados por DNA extraño.
Se han construido fagos ג mutantes diseñados para el clonado del DNA, uno de estos mutantes especialmente utilizado, denominado גgt-גβ, contiene sólo dos puntos de escisión por el EcoRI, en vez de los cinco puntos habituales.
Después de la escisión, puede eliminarse el segmento central de esa molécula de DNA ג. Los dos fragmentos restantes de DNA tienen una longitud conjunta equivalente al 72% del genoma unitario. Esta cantidad de DNA resulta demasiado pequeña para empaquetarse en la cabeza del fago ג. La gama de longitudes que pueden empaquetarse fácilmente varían desde el 75 al 105% del genoma unitario. Sin embargo, la inserción de una cantidad adecuada del DNA ג hace posible la encapsulación de la molécula recombinante (un 93% de la longitud normal). Aproximadamente, todas las partículas ג infecciosas, formadas de esta manera, poseen un fragmento extraño de DNA insertado. Otra ventaja de utilizar como vectores estos virones modificados es que entran en las bacterias con mucha mayor frecuencia que los plásmidos. Para utilizarlos como vectores de clonación se han construido una serie de mutantes del fago ג. Uno de ellos, el llamado cósmido, puede servir como vehículo para grandes fragmentos de DNA (de hasta unas 45 kb).
El fago M13 es otro vector muy útil para clonar DNA. Este virus filamentoso tiene 900 mm de longitud y solo 9 mm de diámetro. Su molécula de DNA circular, de una hebra, de 6,4 kb, se halla protegida por una cápsida de 2710 subunidades proteicas. M13 pasa al interior de E. coli a través de un pilus sexual, una estructura proteica que sobresale de la bacteria. La hebra de DNA que se halla en la partícula vírica (llamada hebra +) se replica a través de una forma de replicación (RF) intermediaria de doble hebra, que contiene hebras + y -, de forma muy parecida a lo que ocurre con ØX174. Solo la hebra + se empaqueta en el interior de las nuevas partículas víricas. Cada generación consta de un millar de partículas de M13. Una notable característica del virus M13 es que no mata a su bacteria hospedadora. Por lo tanto, se puede obtener fácilmente grandes cantidades de M13 en cultivos (1g a partir de 10 L de medio cultivo líquido).
Para clonar con M13, su forma de replicación de DNA circular se corta en un único punto con un enzima de restricción. El corte se hace en una región multiadaptadora (“polylinker”) que contiene una serie de sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios aparece sólo una vez en el vector. La forma RF así abierta se liga a un fragmento de DNA extraño de doble hebra producido por el mismo enzima de restricción. El DNA extraño se puede insertar en el RF con dos orientaciones distintas, porque los extremos de ambas moléculas de DNA son indistinguibles. Por lo tanto, la mitad de las nuevas hebras + empaquetadas en las párticulas víricas van a contener una de las hebras del DNA extraño, y la otra mitad, la otra hebra. Al ser infectado un E. coli por una única partícula vírica se obtendrá una gran cantidad de DNA monocatenario de M13, que contendrá la información de la correspondiente hebra del DNA extraño. Para secuenciar el fragmento de DNA insertado, se utiliza como cebador un oligonucleótido que hibridiza la zona adyacente a la región multiadaptadora. Dicho oligómero se denomina cebador universal de secuenciación, ya que se puede usar para secuenciar cualquier fragmento insertado. El fago M13 es ideal para secuenciar DNA, pero no para propagar DNA recombinante a largo plazo, ya que en los fragmentos insertados mas de 1kb no se mantienen de modo estable en su genoma.

¿QUE ES UN PROMOTOR?
En el ADN este controla la iniciación de la transcripción de ese gen al ARN, este contiene la información para activar o desactivar el gen que regula.
Un promotor se une a la polimerasa, y se encuentra normalmente delante de una secuencia específica de RNA. en el RNA (incluido en el promotor) el primer nucleótido es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto. Delante - y detrás +. El resto del promotor no se transcribe.
En las células procariotas el promotor tiene dos zona comunes que son puntos de reconocimiento de polimerasa en las regiones -10 y -35. Esta secuencia de bases está bastante conservada: Región -10: TATAAT, Región -35: TTGACA
La eficiencia de la transcripción depende de lo bien que reconozca la polimerasa al promotor. Cuanto más se parece el promotor a los anteriores más fuerte es. Las proteínas tienen genes con promotores fuertes. Hay secuencias reguladoras de polimerasas en el mismo promotor.
En un operón hay un promotor controlando la transcripción de varios genes juntos y al final hay una terminación común para todos.
En la transcripción, la RNA polímerasa se une a cualquier sitio de la molécula y busca el promotor rápidamente deslizándose hasta encontrarlo. Se posa donde ve un promotor, pero otras órdenes exteriores le indican el promotor correcto, reconociéndolo estableciendo puentes de hidrógeno en uno determinado. Las zonas de interacción son -10 y -35 dentro del promotor. Cuanto más fuerte sea el promotor más interacciones podrá formar. Este proceso es rápido porque para reconocer promotores no es necesario desenrollar el promotor, se leen las bases a través del surco mayor. En el reconocimiento del promotor interviene σ
En las eucariotas, todos los genes tienen promotor y término. No hay policistrónicos. Con mucha frecuencia en los promotores se da una secuencia llamada caja TATA que está en la región -20. No hay zona en -35.
En la transcripción de las eucariotas, se requiere la presencia de proteínas para reconocer promotores, estos factores transcripcionales se unen al promotor formando un complejo que se une al RNA polimerasa.
En un complejo cerrado, la polimerasa se fija al promotor produciendo un cambio conformacional que da lugar al complejo abierto. Se separan las dos cadenas del promotor del DNA, lo que da lugar a una burbuja de transcripción. La burbuja se desplaza y se sintetizan unos 5 nucleótidos antes de abandonar el promotor.Una parte grande del promotor no se copia en el DNA sino a partir de +1.
¿QUE ES UN OPERON?
Un Operón se define como una unidad genética funcional formada por un grupo o complejo de genes capaces de ejercer una regulación de su propia expresión por medio de los sustratos con los que interaccionan las proteínas codificadas por sus genes. Este complejo esta formado por genes estructurales que codifican para la síntesis de proteínas (generalmente enzimas), que participan en vías metabólicas cuya expresión generalmente está regulada por otros 2 factores de control, llamados: Factor promotor ,Operador.
El operador permite la activación/desactivación del promotor a modo de "interruptor génico" por medio de su interacción con un compuesto inductor. Y de esta manera el promotor dará lugar a la expresión/represión del resto de los genes estructurales.
Un operón es también un conjunto de genes bacterianos que se co-transcriben en una misma molécula de RNA. Debido a la importancia biológica de los operones en coordinar la expresión de genes se encuentran metabólica o funcionalmente relacionados. En principio los genes que pertenecen a un operón podrían ser definidos si los elementos de regulación que delimitan el inicio (promotor) y el final de la transcripción (terminador ) de las unidades transcripcionales pudieran ser. Los operones, de acuerdo a la regulación que presenten, se clasifican como inducibles, reprensibles y constitutivos.
Los operones inducibles son aquellos operones que en condiciones normales no se expresan, pero, en respuesta a un agente inductor se activa, transcribiendo los genes estructurales. El ejemplo clásico de este tipo de operon lo constituye el operon lactosa. Otros ejemplos de operones inducibles son aquellos que codifican para enzimas que participan en el metabolismo de sustratos como operon maltosa, arabinosa, etc...Los operones reprensibles son aquellos operones que en condiciones normales sí se expresan, pero, en respuesta a un agente represor se activan, inhibiendo la transcripción de los genes estructurales. Ejemplos de este tipo de operon son los operones que codifican para la síntesis de aminoácidos, como operon trp, his, etc...Los operones constitutivos son aquellos operones que siempre se expresan, y por lo tanto no están regulados ni por inductores ni por represores.

OPERÓN ARABINOSA
El operón de arabinosa está compuesto por los genes de las enzimas de la arabinosa.
Este tipo de operón es un ejemplo de operón inducible, en este operón la misma proteína reguladora es ejerce control tanto positivo como negativo.
Los genes ara A, B y D son lo que participan en el metabolismo de azúcar arabinosa, y estos se encuentran rregulados por una proteína codificada por la ara C. En ausencia de arabinosa la proteína se puede comportar como un represor haciendo que se una a otros sitios reguladores como en arao o araI, en este caso no ocurre transcripción y el control es negativo.
En presencia de arabinosa se realiza algo parecido a un activador y se estimula la transcripción de ara A, B y D y para este caso el control es positivo.
Stryer L. Bioquímica Cuarta edición tomo I Y II; Reverté, Barcelona 1995 España pp.128-130, 826-27, 950-52, 956-57.