EQUIPO 3 _TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
La práctica de transformación bacteriana con pGLO a pesar de no ser la que correspondía a la práctica designada a ese día que era mini preparaciones de plásmidos, resultó de manera satisfactoria ya que gracias a la ayuda de una profesora de otro grupo que nos proporcionó el plásmido pudimos realizar esta práctica.
Durante el desarrollo de esta práctica tuvimos que descongelar las células en hielo durante unos 15 minutos (aprox.) alternando con el calor de las manos, aumentando la higiene en las manos para no contaminarlas, (lavando las manos antes de tomar las muestras y desinfectando la mesa de trabajo) cuando estas estuvieron listas, el profesor le agrego 10ng del plásmido proporcionado a la muestra etiquetada con pGLO + ya que la muestra de pGLO- es la muestra de control y ambos fueron mezclados por inversión y se les dejo en agua hielo durante 20 minutos y después se le dio un choque térmico por 45 segundos para después ser regresados al agua hielo 5 minutos. Con ayuda de una micro-pipeta el profesor agrego 900 µL del medio LB preparado por nosotros en la práctica anterior y fue incubado durante 40 minutos a 37°, después de esto fue centrifugado y retirado el sobrenadante para que quedara el “botón” con E-coli.
Se repartieron a todos los equipos los medios de cultivo preparados la sesión pasada para cultivar las muestras de pGLO + y pGLO – y ser observadas después de 36 horas bajo luz UV y luz blanca.
En si lo más “pesado” de esta práctica es la espera que se requiere en ciertos pasos y que contábamos con poco de este y por ese motivo en algunos de los pasos que requerían tiempo se tuvo que reducir 10 o 20 minutos.
En los medios de cultivo sembrados con E- coli se presentarón los siguientes resultados:
Medio pGLO Resultado Luminiscencia
LB* y Ampicilina + Crecimiento de colonias No
LB* - Crecimiento de colonias No
LB, Ampicilina y
arabinosa + Crecimiento de colonias Si
LB* y Ampicilina - Crecimiento de colonias No
LB* - Crecimiento de colonias No
LB, Ampicilina y
Arabinosa + Crecimiento de colonias Si
sábado, 22 de mayo de 2010
domingo, 16 de mayo de 2010
Discusion Eq 1 Pract 8 Transformación
En el pGLO – LB hubo presencia de colonias color blanco. El medio de cultivo y las condiciones adecuadas permitieron el crecimiento apropiado de las bacterias como se esperó. Estas bacterias no presentaron la fluorescencia ya que no tenían la proteína verde fluorescente que contenía el plásmido.
En el pGLO – LB ampicilina hubo presencia de unas cuantas colonias de bacterias color blanco. Los resultados esperados bajo las condiciones de la ampicilina eran la ausencia de colonias por la presencia de este antibiótico. Al no poseer el plásmido la ampicilina inhibe la síntesis de la pared celular microbiana y produce la muerte. El hecho de que hubo presencia de bacterias en la caja petri puede ser debido a que la bacteria haya presentado un mecanismo de resistencia al antibiótico. Estos surgen en las poblaciones por mutación y se establecen por la selección que ejerce la presencia del antibiótico en las poblaciones de los microorganismos. Otra posible respuesta a dicha presencia de bacterias es que el medio se pudo haber contaminado con otro tipo de bacterias que se encontraban presente en el ambiente y que no tienen la sensibilidad a la ampicilina debido a que este antibiótico es de espectro limitado; actúa sólo en un sector restringido (cocos gram negativos y gram positivos, espiroquetas y bacterias gram positivas). Ahora bien, si las bacterias que crecieron en el medio son resistentes al antibiótico debieron de haber crecido de igual forma que las bacterias en el pGLO + LB ampicilina, y crecieron muy poco, lo que nos dice que tienen cierta sensibilidad al antibiótico.
En el pGLO + LB ampicilina las bacterias crecieron apropiadamente y se observó un número alto de colonias color blanco. Estas bacterias adquirieron resistencia antibiótica por medio de la transferencia horizontal de genes que ya son resistentes a antibióticos, alterando los genes de la célula transformada. El plásmido pGLO inyectado en las bacterias presentaba un gen resistente a la ampicilina, y al incorporarse en el ADN de la bacteria transformadora traspasó a esta dicha característica. Estas bacterias no presentaron fluorescencia ya que el medio de cultivo no contenía arabinosa; dicho sustrato activa al gen del plásmido que produce la fluorescencia.
En el pGLO + LB ampicilina arabinosa las bacterias crecieron como se esperó con un color verde fluorescente. Esta característica fue otorgada del mismo modo que la resistencia antibiótica: por transformación. En este caso hay nuevamente resistencia frente al antibiótico (característica del pGLO). Todas estas bacterias transformadas con pGLO presentan a su vez la proteína fluorescente que da el color. Las células originales se dividieron y multiplicaron en colonias idénticas. Lo que provocó el color verde fluorescente en las células transformadoras fue la activación de la proteína (GFP) por medio de la azúcar arabinosa que se añadió al medio de cultivo. Esta azúcar dio la señal a la enzima DNA polimerasa para que sintetice la proteína expresando el color.
En el pGLO – LB ampicilina hubo presencia de unas cuantas colonias de bacterias color blanco. Los resultados esperados bajo las condiciones de la ampicilina eran la ausencia de colonias por la presencia de este antibiótico. Al no poseer el plásmido la ampicilina inhibe la síntesis de la pared celular microbiana y produce la muerte. El hecho de que hubo presencia de bacterias en la caja petri puede ser debido a que la bacteria haya presentado un mecanismo de resistencia al antibiótico. Estos surgen en las poblaciones por mutación y se establecen por la selección que ejerce la presencia del antibiótico en las poblaciones de los microorganismos. Otra posible respuesta a dicha presencia de bacterias es que el medio se pudo haber contaminado con otro tipo de bacterias que se encontraban presente en el ambiente y que no tienen la sensibilidad a la ampicilina debido a que este antibiótico es de espectro limitado; actúa sólo en un sector restringido (cocos gram negativos y gram positivos, espiroquetas y bacterias gram positivas). Ahora bien, si las bacterias que crecieron en el medio son resistentes al antibiótico debieron de haber crecido de igual forma que las bacterias en el pGLO + LB ampicilina, y crecieron muy poco, lo que nos dice que tienen cierta sensibilidad al antibiótico.
En el pGLO + LB ampicilina las bacterias crecieron apropiadamente y se observó un número alto de colonias color blanco. Estas bacterias adquirieron resistencia antibiótica por medio de la transferencia horizontal de genes que ya son resistentes a antibióticos, alterando los genes de la célula transformada. El plásmido pGLO inyectado en las bacterias presentaba un gen resistente a la ampicilina, y al incorporarse en el ADN de la bacteria transformadora traspasó a esta dicha característica. Estas bacterias no presentaron fluorescencia ya que el medio de cultivo no contenía arabinosa; dicho sustrato activa al gen del plásmido que produce la fluorescencia.
En el pGLO + LB ampicilina arabinosa las bacterias crecieron como se esperó con un color verde fluorescente. Esta característica fue otorgada del mismo modo que la resistencia antibiótica: por transformación. En este caso hay nuevamente resistencia frente al antibiótico (característica del pGLO). Todas estas bacterias transformadas con pGLO presentan a su vez la proteína fluorescente que da el color. Las células originales se dividieron y multiplicaron en colonias idénticas. Lo que provocó el color verde fluorescente en las células transformadoras fue la activación de la proteína (GFP) por medio de la azúcar arabinosa que se añadió al medio de cultivo. Esta azúcar dio la señal a la enzima DNA polimerasa para que sintetice la proteína expresando el color.
jueves, 13 de mayo de 2010
Equipo 2 Discusión de practica 4: cinética enzimática
Realizando la observación de las gráficas que se obtienen en los resultados, se puede apreciar la forma en que interactúa Vo con cada uno de los datos obtenidos, en la realización de la práctica, o bien, en los cálculos realizados para poder hacer las gráficas. Se observa que todos los datos afectan de manera directa la acción de la velocidad de la reacción modificando Vo si se modifica alguno de estos datos. Por
Por otra parte, se obtuvieron los valores de la velocidad de reacción de la enzima, en una grafica que al principio se describe como lineal, porque a bajas concentraciones de sustrato la enzima permanece en equilibrio constante, pero con el aumento de la concentración se va curvando, identificando por varios métodos, como el de Michaelis-Menten, la velocidad inicial o media a partir de la Vmax que se usa como un valor constante, y la afinidad de la enzima sobre los sustratos (Km); la diferencia entre estos es la facilidad que hay dentro de sus ecuaciones para distinguir a Km y Vmax.
En dicha grafica se observa el tiempo y la velocidad inicial en la pendiente, la inversa de la Vmax en el corte con el eje de las ordenadas, y el valor de -1/Km en las abscisas, siendo que 1(S) se iguala a 0 y es el valor mínimo posible, pero con este se hayan estimaciones inexactas.
Por otra parte, se obtuvieron los valores de la velocidad de reacción de la enzima, en una grafica que al principio se describe como lineal, porque a bajas concentraciones de sustrato la enzima permanece en equilibrio constante, pero con el aumento de la concentración se va curvando, identificando por varios métodos, como el de Michaelis-Menten, la velocidad inicial o media a partir de la Vmax que se usa como un valor constante, y la afinidad de la enzima sobre los sustratos (Km); la diferencia entre estos es la facilidad que hay dentro de sus ecuaciones para distinguir a Km y Vmax.
En dicha grafica se observa el tiempo y la velocidad inicial en la pendiente, la inversa de la Vmax en el corte con el eje de las ordenadas, y el valor de -1/Km en las abscisas, siendo que 1(S) se iguala a 0 y es el valor mínimo posible, pero con este se hayan estimaciones inexactas.
sábado, 8 de mayo de 2010
Discusión Eq 1 Prac 5 Cinetica Enz
En la práctica se analizó la absorbancia de DOPA que tuvieron cada uno de los tubos, los cuales contenían diferente cantidad de amortiguador de fosfato 0.1 M y solución de L-DOPA.
Además de calculó la masa de DOPA, la concentración de sustrato y la velocidad.
En la tabla 1 se puede ver la absorbancia de cada uno de los tubos en intervalos de 10 segundos y nos dio que los tubos 5 y 6 fueron los de mayor absorbancia de DOPA, pues fueron a los tubos que se les puso la mayor cantidad de L-DOPA, teniendo 1.25 ml el tubo 5, y 1.5 ml el tubo 6.
En las gráficas 1 y 2 observamos cómo fue siendo la absorbancia de DOPA y su regresión lineal.
Vemos como el tubo 1 tiene una absorbancia 0, pues no tenía nada de L-DOPA, se le vertió puro amortiguador de fosfato 0.1 M.
Con forme se le fue añadiendo la solución L-DOPA, el grado de absorbancia fue siendo mayor, hasta llegar a 0.51 en el tubo 6 a los 90 segundos.
En la tabla 2 se pueden ver los resultado obtenidos después de hacer los cálculos para sacar la masa, concentración, pendientes, velocidad, y así poder hacer las gráficas requeridas para la cinética.
La Gráfica 3 nos da la velocidad que tuvo la reacción en función de la concentración del sustrato en mM. Vemos como la velocidad va aumentando pero al llegar a cierto punto en que la concentración también aumenta, la velocidad disminuye. Esto se debe a que en las reacciones enzimáticas, llega un momento en el cual la velocidad llega a un tope, y es cuando se dice que está saturada la enzima.
La Gráfica 4 es la representación gráfica de Lineweaver-Burk, relacionando 1/v por 1/s, la cual permite identificar el Km y Vmax.
Entonces se sacó la velocidad máxima y nos dio que es de 0.0747 Mm/min, y así también se sacó la Km, dándonos un resultado de 5.6493 mM.
En la Gráfica 5 se d ala representación de gráfica de Eadie Hofstee, la cual relaciona la velocidad de la reacción con la concentración del sustrato. Calculando dio una velocidad máxima de 0.0476 Mm/min y un Km de 2.8281 mM.
El digrama Eadie-Hofstee está menos afectada por el margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke, debido a que asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentración del sustrato o de la velocidad de reacción, por lo que debemos de hacerle más caso a los resultados obtenidos por este método que por el de Lineweaver-Burke.
Fijándonos en la Gráfica 3 se ve como la velocidad más máxima a la que llega la reacción si concuerda con los datos obtenidos por el método de Eadie Hofstee.
jueves, 6 de mayo de 2010
TRANSFORMACION BACTERIANA CON pGLO
En este practica se realizará una transformación genética. Un gen es un pedazo de DNA el cual provee las instrucciones para hacer (o codifica para) una proteína. Esta proteína le da a un organismo una característica particular.
La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material genético (DNA). Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación. Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo.
La transformación genética es utilizada en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura genes que codifican para características como la resistencia en contra de descomposición, congelación y alimañas pueden ser transformadas genéticamente en las plantas. En la biorremediación, bacterias pueden ser genéticamente transformadas con genes que le permiten digerir derrames de petróleo. En la medicina, enfermedades causadas por genes defectuosos se están empezando a tratar con terapia genética; en otras palabras se transforma genéticamente la célula de una persona enferma con copia sana del gen defectuoso que causa la enfermedad.
En la practica se utilizará un procedimiento que transformará la bacteria E. coli con un gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extraído de una medusa o “agua viva” llamada Aequorea victoria que es fluorescente y bioluminiscente. La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.
Las bacterias además de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos (uno o más de estos). El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características que pueden ser beneficiosas para la sobrevivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias pueden transferir plásmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. El plásmido pGLO contiene el gen para hacer la GFP.
Los plásmidos pGLO únicos de Bio-Rad contienen además un gen de resistencia al antibiótico ampicilina (amp). El pGLO también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células.
La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material genético (DNA). Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación. Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo.
La transformación genética es utilizada en muchas áreas de la biotecnología. En la agricultura genes que codifican para características como la resistencia en contra de descomposición, congelación y alimañas pueden ser transformadas genéticamente en las plantas. En la biorremediación, bacterias pueden ser genéticamente transformadas con genes que le permiten digerir derrames de petróleo. En la medicina, enfermedades causadas por genes defectuosos se están empezando a tratar con terapia genética; en otras palabras se transforma genéticamente la célula de una persona enferma con copia sana del gen defectuoso que causa la enfermedad.
En la practica se utilizará un procedimiento que transformará la bacteria E. coli con un gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extraído de una medusa o “agua viva” llamada Aequorea victoria que es fluorescente y bioluminiscente. La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.
Las bacterias además de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos (uno o más de estos). El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características que pueden ser beneficiosas para la sobrevivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias pueden transferir plásmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. El plásmido pGLO contiene el gen para hacer la GFP.
Los plásmidos pGLO únicos de Bio-Rad contienen además un gen de resistencia al antibiótico ampicilina (amp). El pGLO también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células.
lunes, 3 de mayo de 2010
Equipo 2. Introducción de práctia 6 minipreparaciones de plásmido PGLO
¿QUÉ ES UN PLÁSMIDO?
Son pequeñas moléculas del DNA extracromosómico que aparecen en el citoplasma y que aportan solamente unos genes; se pueden llamar como plásmidos ó episomas según con la relación genética con el DNA cromosómico. La mayoría de las células contiene de 1 a 20 moléculas de plásmidos, estos se parecen en tamaño a los DNAs virales, están comprendidos entre 5 y100 megadaltones, se replican en números fijos junto con los cromosomas, los llamados episomas se incorporan al cromosoma de la célula huésped. Los plásmidos pueden ser transferidos de una célula bacteriana a otra durante la conjugación sexuada, confiriendo así nuevas características fenotípicas a la célula recipiendaria. Las bacterias, a diferencia de las células eucariotas (por ejemplo las que forman nuestro cuerpo) a parte de su ADN genómico heredado o cromosoma bacteriano, poseen otro tipo de ADN que "se lo pasan" de unas a otras. Es lo que se llama la herencia o transferencia horizontal. Una bacteria se encuenentra a otra y es capaz de pasarle de forma fisiológica y controlada una copia de ese ADN. Pues bien esos ADN son los "plásmidos". Son trozos de ADN circulares y cerrados covalentemente (ccc) y les sirven porque gracias a ellos adquieren algún caracter fenótípico nuevo, por ejemplo, resistencia a la ampicilina.
Pues bien, la utilización de estos plásmidos en los laboratorios ha representado uno de los mayores avances en la ciencia de los últimos 40 años.
Si se toma ese plásmido, se abre por un sitio para dejarlo lineal y a eso le unes un trozo de ADN o un gen (que a tí te interesa investigar)y posteriormente lo cierras de nuevo para dejarlo circular, hemos conseguido vectorizar ese trozo de ADN que nos interesa y ahora somos capaces de "meterlo" dentro de la bacteria reconociendolo como suyo. De otra forma, la bacteria rompería el ADN sin vectorizar.
¿QUÉ ES UN VECTOR DE CLONACIÓN?
LOS PLÁSMIDOS Y EL FAGO LAMBDA SON VECTORES DE ELECCIÓN PARA EL CLONADO DE DNA EN LAS BACTERIAS.
Uno de los plásmidos más útiles para el clonado es pBR322, que contiene genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina (un antibiótico análogo a la penicilina). Este plásmido contiene una serie de lugares concretos que pueden ser atacados por endonucleasas específicas para luego introducir fragmentos de DNA. La inserción de DNA en el punto de restricción de la EcoRI no altera ninguno de los dos genes de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, la inserción en los puntos de restricción de las HindIII. SalI o BamHI inactiva el gen de resistencia a la tetraciclina, un efecto que se denomina inactivación insercional. Las células que contienen el pBR322 con un DNA insertado son resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, y así pueden seleccionarse fácilmente. Las células que no consiguieron captar el vector son sensibles a los dos antibióticos, mientras que las que captaron el pBR322 sin DNA insertados son resistentes en ambos.
El fago lambda (ג) en otro vector ampliamente utilizado. Este bacteriófago puede disfrutar de do estilos de vida distintos: puede destruir a su hospedador, o bien puede pasar a formar parte de él. En el ciclo lítico las funciones víricas aparecen plenamente expresadas: el DNA y las proteínas víricas se producen rápidamente y se empaquetan en forma de partículas víricas, que llevan a la lisis (destrucción) de la célula hospedadora, y a la brusca aparición de una progenie de unas 100 partículas víricas o virones. En la ciclo lisogénico, el DNA del fago resulta integrado en el genoma de la célula que lo alberga y puede replicarse junto con el DNA de esta célula durante muchas generaciones permaneciendo inactivo. Ciertos cambios ambientales pueden desencadenar la expresión de este DNA vírico durmiente, con lo que tiene lugar la formación de progenie vírica y se desencadena la lisis del hospedador, Largas secuencias del DNA de 48 kb del fago ג no son esenciales para la infección lítica, y pueden ser remplazados por DNA extraño.
Se han construido fagos ג mutantes diseñados para el clonado del DNA, uno de estos mutantes especialmente utilizado, denominado גgt-גβ, contiene sólo dos puntos de escisión por el EcoRI, en vez de los cinco puntos habituales.
Después de la escisión, puede eliminarse el segmento central de esa molécula de DNA ג. Los dos fragmentos restantes de DNA tienen una longitud conjunta equivalente al 72% del genoma unitario. Esta cantidad de DNA resulta demasiado pequeña para empaquetarse en la cabeza del fago ג. La gama de longitudes que pueden empaquetarse fácilmente varían desde el 75 al 105% del genoma unitario. Sin embargo, la inserción de una cantidad adecuada del DNA ג hace posible la encapsulación de la molécula recombinante (un 93% de la longitud normal). Aproximadamente, todas las partículas ג infecciosas, formadas de esta manera, poseen un fragmento extraño de DNA insertado. Otra ventaja de utilizar como vectores estos virones modificados es que entran en las bacterias con mucha mayor frecuencia que los plásmidos. Para utilizarlos como vectores de clonación se han construido una serie de mutantes del fago ג. Uno de ellos, el llamado cósmido, puede servir como vehículo para grandes fragmentos de DNA (de hasta unas 45 kb).
El fago M13 es otro vector muy útil para clonar DNA. Este virus filamentoso tiene 900 mm de longitud y solo 9 mm de diámetro. Su molécula de DNA circular, de una hebra, de 6,4 kb, se halla protegida por una cápsida de 2710 subunidades proteicas. M13 pasa al interior de E. coli a través de un pilus sexual, una estructura proteica que sobresale de la bacteria. La hebra de DNA que se halla en la partícula vírica (llamada hebra +) se replica a través de una forma de replicación (RF) intermediaria de doble hebra, que contiene hebras + y -, de forma muy parecida a lo que ocurre con ØX174. Solo la hebra + se empaqueta en el interior de las nuevas partículas víricas. Cada generación consta de un millar de partículas de M13. Una notable característica del virus M13 es que no mata a su bacteria hospedadora. Por lo tanto, se puede obtener fácilmente grandes cantidades de M13 en cultivos (1g a partir de 10 L de medio cultivo líquido).
Para clonar con M13, su forma de replicación de DNA circular se corta en un único punto con un enzima de restricción. El corte se hace en una región multiadaptadora (“polylinker”) que contiene una serie de sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios aparece sólo una vez en el vector. La forma RF así abierta se liga a un fragmento de DNA extraño de doble hebra producido por el mismo enzima de restricción. El DNA extraño se puede insertar en el RF con dos orientaciones distintas, porque los extremos de ambas moléculas de DNA son indistinguibles. Por lo tanto, la mitad de las nuevas hebras + empaquetadas en las párticulas víricas van a contener una de las hebras del DNA extraño, y la otra mitad, la otra hebra. Al ser infectado un E. coli por una única partícula vírica se obtendrá una gran cantidad de DNA monocatenario de M13, que contendrá la información de la correspondiente hebra del DNA extraño. Para secuenciar el fragmento de DNA insertado, se utiliza como cebador un oligonucleótido que hibridiza la zona adyacente a la región multiadaptadora. Dicho oligómero se denomina cebador universal de secuenciación, ya que se puede usar para secuenciar cualquier fragmento insertado. El fago M13 es ideal para secuenciar DNA, pero no para propagar DNA recombinante a largo plazo, ya que en los fragmentos insertados mas de 1kb no se mantienen de modo estable en su genoma.
¿QUE ES UN PROMOTOR?
En el ADN este controla la iniciación de la transcripción de ese gen al ARN, este contiene la información para activar o desactivar el gen que regula.
Un promotor se une a la polimerasa, y se encuentra normalmente delante de una secuencia específica de RNA. en el RNA (incluido en el promotor) el primer nucleótido es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto. Delante - y detrás +. El resto del promotor no se transcribe.
En las células procariotas el promotor tiene dos zona comunes que son puntos de reconocimiento de polimerasa en las regiones -10 y -35. Esta secuencia de bases está bastante conservada: Región -10: TATAAT, Región -35: TTGACA
La eficiencia de la transcripción depende de lo bien que reconozca la polimerasa al promotor. Cuanto más se parece el promotor a los anteriores más fuerte es. Las proteínas tienen genes con promotores fuertes. Hay secuencias reguladoras de polimerasas en el mismo promotor.
En un operón hay un promotor controlando la transcripción de varios genes juntos y al final hay una terminación común para todos.
En la transcripción, la RNA polímerasa se une a cualquier sitio de la molécula y busca el promotor rápidamente deslizándose hasta encontrarlo. Se posa donde ve un promotor, pero otras órdenes exteriores le indican el promotor correcto, reconociéndolo estableciendo puentes de hidrógeno en uno determinado. Las zonas de interacción son -10 y -35 dentro del promotor. Cuanto más fuerte sea el promotor más interacciones podrá formar. Este proceso es rápido porque para reconocer promotores no es necesario desenrollar el promotor, se leen las bases a través del surco mayor. En el reconocimiento del promotor interviene σ
En las eucariotas, todos los genes tienen promotor y término. No hay policistrónicos. Con mucha frecuencia en los promotores se da una secuencia llamada caja TATA que está en la región -20. No hay zona en -35.
En la transcripción de las eucariotas, se requiere la presencia de proteínas para reconocer promotores, estos factores transcripcionales se unen al promotor formando un complejo que se une al RNA polimerasa.
En un complejo cerrado, la polimerasa se fija al promotor produciendo un cambio conformacional que da lugar al complejo abierto. Se separan las dos cadenas del promotor del DNA, lo que da lugar a una burbuja de transcripción. La burbuja se desplaza y se sintetizan unos 5 nucleótidos antes de abandonar el promotor.Una parte grande del promotor no se copia en el DNA sino a partir de +1.
¿QUE ES UN OPERON?
Un Operón se define como una unidad genética funcional formada por un grupo o complejo de genes capaces de ejercer una regulación de su propia expresión por medio de los sustratos con los que interaccionan las proteínas codificadas por sus genes. Este complejo esta formado por genes estructurales que codifican para la síntesis de proteínas (generalmente enzimas), que participan en vías metabólicas cuya expresión generalmente está regulada por otros 2 factores de control, llamados: Factor promotor ,Operador.
El operador permite la activación/desactivación del promotor a modo de "interruptor génico" por medio de su interacción con un compuesto inductor. Y de esta manera el promotor dará lugar a la expresión/represión del resto de los genes estructurales.
Un operón es también un conjunto de genes bacterianos que se co-transcriben en una misma molécula de RNA. Debido a la importancia biológica de los operones en coordinar la expresión de genes se encuentran metabólica o funcionalmente relacionados. En principio los genes que pertenecen a un operón podrían ser definidos si los elementos de regulación que delimitan el inicio (promotor) y el final de la transcripción (terminador ) de las unidades transcripcionales pudieran ser. Los operones, de acuerdo a la regulación que presenten, se clasifican como inducibles, reprensibles y constitutivos.
Los operones inducibles son aquellos operones que en condiciones normales no se expresan, pero, en respuesta a un agente inductor se activa, transcribiendo los genes estructurales. El ejemplo clásico de este tipo de operon lo constituye el operon lactosa. Otros ejemplos de operones inducibles son aquellos que codifican para enzimas que participan en el metabolismo de sustratos como operon maltosa, arabinosa, etc...Los operones reprensibles son aquellos operones que en condiciones normales sí se expresan, pero, en respuesta a un agente represor se activan, inhibiendo la transcripción de los genes estructurales. Ejemplos de este tipo de operon son los operones que codifican para la síntesis de aminoácidos, como operon trp, his, etc...Los operones constitutivos son aquellos operones que siempre se expresan, y por lo tanto no están regulados ni por inductores ni por represores.
OPERÓN ARABINOSA
El operón de arabinosa está compuesto por los genes de las enzimas de la arabinosa.
Este tipo de operón es un ejemplo de operón inducible, en este operón la misma proteína reguladora es ejerce control tanto positivo como negativo.
Los genes ara A, B y D son lo que participan en el metabolismo de azúcar arabinosa, y estos se encuentran rregulados por una proteína codificada por la ara C. En ausencia de arabinosa la proteína se puede comportar como un represor haciendo que se una a otros sitios reguladores como en arao o araI, en este caso no ocurre transcripción y el control es negativo.
En presencia de arabinosa se realiza algo parecido a un activador y se estimula la transcripción de ara A, B y D y para este caso el control es positivo.
Stryer L. Bioquímica Cuarta edición tomo I Y II; Reverté, Barcelona 1995 España pp.128-130, 826-27, 950-52, 956-57.
Son pequeñas moléculas del DNA extracromosómico que aparecen en el citoplasma y que aportan solamente unos genes; se pueden llamar como plásmidos ó episomas según con la relación genética con el DNA cromosómico. La mayoría de las células contiene de 1 a 20 moléculas de plásmidos, estos se parecen en tamaño a los DNAs virales, están comprendidos entre 5 y100 megadaltones, se replican en números fijos junto con los cromosomas, los llamados episomas se incorporan al cromosoma de la célula huésped. Los plásmidos pueden ser transferidos de una célula bacteriana a otra durante la conjugación sexuada, confiriendo así nuevas características fenotípicas a la célula recipiendaria. Las bacterias, a diferencia de las células eucariotas (por ejemplo las que forman nuestro cuerpo) a parte de su ADN genómico heredado o cromosoma bacteriano, poseen otro tipo de ADN que "se lo pasan" de unas a otras. Es lo que se llama la herencia o transferencia horizontal. Una bacteria se encuenentra a otra y es capaz de pasarle de forma fisiológica y controlada una copia de ese ADN. Pues bien esos ADN son los "plásmidos". Son trozos de ADN circulares y cerrados covalentemente (ccc) y les sirven porque gracias a ellos adquieren algún caracter fenótípico nuevo, por ejemplo, resistencia a la ampicilina.
Pues bien, la utilización de estos plásmidos en los laboratorios ha representado uno de los mayores avances en la ciencia de los últimos 40 años.
Si se toma ese plásmido, se abre por un sitio para dejarlo lineal y a eso le unes un trozo de ADN o un gen (que a tí te interesa investigar)y posteriormente lo cierras de nuevo para dejarlo circular, hemos conseguido vectorizar ese trozo de ADN que nos interesa y ahora somos capaces de "meterlo" dentro de la bacteria reconociendolo como suyo. De otra forma, la bacteria rompería el ADN sin vectorizar.
¿QUÉ ES UN VECTOR DE CLONACIÓN?
LOS PLÁSMIDOS Y EL FAGO LAMBDA SON VECTORES DE ELECCIÓN PARA EL CLONADO DE DNA EN LAS BACTERIAS.
Uno de los plásmidos más útiles para el clonado es pBR322, que contiene genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina (un antibiótico análogo a la penicilina). Este plásmido contiene una serie de lugares concretos que pueden ser atacados por endonucleasas específicas para luego introducir fragmentos de DNA. La inserción de DNA en el punto de restricción de la EcoRI no altera ninguno de los dos genes de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, la inserción en los puntos de restricción de las HindIII. SalI o BamHI inactiva el gen de resistencia a la tetraciclina, un efecto que se denomina inactivación insercional. Las células que contienen el pBR322 con un DNA insertado son resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, y así pueden seleccionarse fácilmente. Las células que no consiguieron captar el vector son sensibles a los dos antibióticos, mientras que las que captaron el pBR322 sin DNA insertados son resistentes en ambos.
El fago lambda (ג) en otro vector ampliamente utilizado. Este bacteriófago puede disfrutar de do estilos de vida distintos: puede destruir a su hospedador, o bien puede pasar a formar parte de él. En el ciclo lítico las funciones víricas aparecen plenamente expresadas: el DNA y las proteínas víricas se producen rápidamente y se empaquetan en forma de partículas víricas, que llevan a la lisis (destrucción) de la célula hospedadora, y a la brusca aparición de una progenie de unas 100 partículas víricas o virones. En la ciclo lisogénico, el DNA del fago resulta integrado en el genoma de la célula que lo alberga y puede replicarse junto con el DNA de esta célula durante muchas generaciones permaneciendo inactivo. Ciertos cambios ambientales pueden desencadenar la expresión de este DNA vírico durmiente, con lo que tiene lugar la formación de progenie vírica y se desencadena la lisis del hospedador, Largas secuencias del DNA de 48 kb del fago ג no son esenciales para la infección lítica, y pueden ser remplazados por DNA extraño.
Se han construido fagos ג mutantes diseñados para el clonado del DNA, uno de estos mutantes especialmente utilizado, denominado גgt-גβ, contiene sólo dos puntos de escisión por el EcoRI, en vez de los cinco puntos habituales.
Después de la escisión, puede eliminarse el segmento central de esa molécula de DNA ג. Los dos fragmentos restantes de DNA tienen una longitud conjunta equivalente al 72% del genoma unitario. Esta cantidad de DNA resulta demasiado pequeña para empaquetarse en la cabeza del fago ג. La gama de longitudes que pueden empaquetarse fácilmente varían desde el 75 al 105% del genoma unitario. Sin embargo, la inserción de una cantidad adecuada del DNA ג hace posible la encapsulación de la molécula recombinante (un 93% de la longitud normal). Aproximadamente, todas las partículas ג infecciosas, formadas de esta manera, poseen un fragmento extraño de DNA insertado. Otra ventaja de utilizar como vectores estos virones modificados es que entran en las bacterias con mucha mayor frecuencia que los plásmidos. Para utilizarlos como vectores de clonación se han construido una serie de mutantes del fago ג. Uno de ellos, el llamado cósmido, puede servir como vehículo para grandes fragmentos de DNA (de hasta unas 45 kb).
El fago M13 es otro vector muy útil para clonar DNA. Este virus filamentoso tiene 900 mm de longitud y solo 9 mm de diámetro. Su molécula de DNA circular, de una hebra, de 6,4 kb, se halla protegida por una cápsida de 2710 subunidades proteicas. M13 pasa al interior de E. coli a través de un pilus sexual, una estructura proteica que sobresale de la bacteria. La hebra de DNA que se halla en la partícula vírica (llamada hebra +) se replica a través de una forma de replicación (RF) intermediaria de doble hebra, que contiene hebras + y -, de forma muy parecida a lo que ocurre con ØX174. Solo la hebra + se empaqueta en el interior de las nuevas partículas víricas. Cada generación consta de un millar de partículas de M13. Una notable característica del virus M13 es que no mata a su bacteria hospedadora. Por lo tanto, se puede obtener fácilmente grandes cantidades de M13 en cultivos (1g a partir de 10 L de medio cultivo líquido).
Para clonar con M13, su forma de replicación de DNA circular se corta en un único punto con un enzima de restricción. El corte se hace en una región multiadaptadora (“polylinker”) que contiene una serie de sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios de reconocimiento, cercanos entre si, de enzimas de restricción; cada uno de estos sitios aparece sólo una vez en el vector. La forma RF así abierta se liga a un fragmento de DNA extraño de doble hebra producido por el mismo enzima de restricción. El DNA extraño se puede insertar en el RF con dos orientaciones distintas, porque los extremos de ambas moléculas de DNA son indistinguibles. Por lo tanto, la mitad de las nuevas hebras + empaquetadas en las párticulas víricas van a contener una de las hebras del DNA extraño, y la otra mitad, la otra hebra. Al ser infectado un E. coli por una única partícula vírica se obtendrá una gran cantidad de DNA monocatenario de M13, que contendrá la información de la correspondiente hebra del DNA extraño. Para secuenciar el fragmento de DNA insertado, se utiliza como cebador un oligonucleótido que hibridiza la zona adyacente a la región multiadaptadora. Dicho oligómero se denomina cebador universal de secuenciación, ya que se puede usar para secuenciar cualquier fragmento insertado. El fago M13 es ideal para secuenciar DNA, pero no para propagar DNA recombinante a largo plazo, ya que en los fragmentos insertados mas de 1kb no se mantienen de modo estable en su genoma.
¿QUE ES UN PROMOTOR?
En el ADN este controla la iniciación de la transcripción de ese gen al ARN, este contiene la información para activar o desactivar el gen que regula.
Un promotor se une a la polimerasa, y se encuentra normalmente delante de una secuencia específica de RNA. en el RNA (incluido en el promotor) el primer nucleótido es el +1 y todas las bases se toman desde ese punto. Delante - y detrás +. El resto del promotor no se transcribe.
En las células procariotas el promotor tiene dos zona comunes que son puntos de reconocimiento de polimerasa en las regiones -10 y -35. Esta secuencia de bases está bastante conservada: Región -10: TATAAT, Región -35: TTGACA
La eficiencia de la transcripción depende de lo bien que reconozca la polimerasa al promotor. Cuanto más se parece el promotor a los anteriores más fuerte es. Las proteínas tienen genes con promotores fuertes. Hay secuencias reguladoras de polimerasas en el mismo promotor.
En un operón hay un promotor controlando la transcripción de varios genes juntos y al final hay una terminación común para todos.
En la transcripción, la RNA polímerasa se une a cualquier sitio de la molécula y busca el promotor rápidamente deslizándose hasta encontrarlo. Se posa donde ve un promotor, pero otras órdenes exteriores le indican el promotor correcto, reconociéndolo estableciendo puentes de hidrógeno en uno determinado. Las zonas de interacción son -10 y -35 dentro del promotor. Cuanto más fuerte sea el promotor más interacciones podrá formar. Este proceso es rápido porque para reconocer promotores no es necesario desenrollar el promotor, se leen las bases a través del surco mayor. En el reconocimiento del promotor interviene σ
En las eucariotas, todos los genes tienen promotor y término. No hay policistrónicos. Con mucha frecuencia en los promotores se da una secuencia llamada caja TATA que está en la región -20. No hay zona en -35.
En la transcripción de las eucariotas, se requiere la presencia de proteínas para reconocer promotores, estos factores transcripcionales se unen al promotor formando un complejo que se une al RNA polimerasa.
En un complejo cerrado, la polimerasa se fija al promotor produciendo un cambio conformacional que da lugar al complejo abierto. Se separan las dos cadenas del promotor del DNA, lo que da lugar a una burbuja de transcripción. La burbuja se desplaza y se sintetizan unos 5 nucleótidos antes de abandonar el promotor.Una parte grande del promotor no se copia en el DNA sino a partir de +1.
¿QUE ES UN OPERON?
Un Operón se define como una unidad genética funcional formada por un grupo o complejo de genes capaces de ejercer una regulación de su propia expresión por medio de los sustratos con los que interaccionan las proteínas codificadas por sus genes. Este complejo esta formado por genes estructurales que codifican para la síntesis de proteínas (generalmente enzimas), que participan en vías metabólicas cuya expresión generalmente está regulada por otros 2 factores de control, llamados: Factor promotor ,Operador.
El operador permite la activación/desactivación del promotor a modo de "interruptor génico" por medio de su interacción con un compuesto inductor. Y de esta manera el promotor dará lugar a la expresión/represión del resto de los genes estructurales.
Un operón es también un conjunto de genes bacterianos que se co-transcriben en una misma molécula de RNA. Debido a la importancia biológica de los operones en coordinar la expresión de genes se encuentran metabólica o funcionalmente relacionados. En principio los genes que pertenecen a un operón podrían ser definidos si los elementos de regulación que delimitan el inicio (promotor) y el final de la transcripción (terminador ) de las unidades transcripcionales pudieran ser. Los operones, de acuerdo a la regulación que presenten, se clasifican como inducibles, reprensibles y constitutivos.
Los operones inducibles son aquellos operones que en condiciones normales no se expresan, pero, en respuesta a un agente inductor se activa, transcribiendo los genes estructurales. El ejemplo clásico de este tipo de operon lo constituye el operon lactosa. Otros ejemplos de operones inducibles son aquellos que codifican para enzimas que participan en el metabolismo de sustratos como operon maltosa, arabinosa, etc...Los operones reprensibles son aquellos operones que en condiciones normales sí se expresan, pero, en respuesta a un agente represor se activan, inhibiendo la transcripción de los genes estructurales. Ejemplos de este tipo de operon son los operones que codifican para la síntesis de aminoácidos, como operon trp, his, etc...Los operones constitutivos son aquellos operones que siempre se expresan, y por lo tanto no están regulados ni por inductores ni por represores.
OPERÓN ARABINOSA
El operón de arabinosa está compuesto por los genes de las enzimas de la arabinosa.
Este tipo de operón es un ejemplo de operón inducible, en este operón la misma proteína reguladora es ejerce control tanto positivo como negativo.
Los genes ara A, B y D son lo que participan en el metabolismo de azúcar arabinosa, y estos se encuentran rregulados por una proteína codificada por la ara C. En ausencia de arabinosa la proteína se puede comportar como un represor haciendo que se una a otros sitios reguladores como en arao o araI, en este caso no ocurre transcripción y el control es negativo.
En presencia de arabinosa se realiza algo parecido a un activador y se estimula la transcripción de ara A, B y D y para este caso el control es positivo.
Stryer L. Bioquímica Cuarta edición tomo I Y II; Reverté, Barcelona 1995 España pp.128-130, 826-27, 950-52, 956-57.
equipo 2. Discuión de práctica 3 Cuantificación de proteínas
En los resultados obtenidos se observa que la absorbancia de los tubos influye en la coloración que se obtiene en cada uno. Como se había observando de manera teórica, los tubos tomarían una coloración al agregarse el reactivo de Biuret, de acuerdo con la teoría los tubos tomaron la coloración azul o violeta dependiendo de la concentración de la proteína en cada tubo, en este caso representando el color azul cuando no había tanta proteína en el tubo y el color violeta o más intenso en un tubo con mayor cantidad de proteína. Por esto se puede observar que la absorbancia dependerá de la cantidad de proteína. Además se puede observar al llevar cada uno al espectrofotómetro que los tubos que contienen mayor cantidad de proteína indicaran una mayor cantidad visible de la absorbancia.
De acuerdo a los datos obtenidos por la gráfica que representa la cantidad de absorbancia de la proteína y con la curva patrón realizada con la albúmina, se tiene que según la teoría, los datos deberían de estar relacionados según el ajuste de mínimos cuadrados, es decir, debería de arrojarse como resultado que existe una relación entre la absorbancia y la concentración de la proteína, en este caso la teoría nos proporciona (al igual del punto anterior discutido) que realmente la cantidad de proteína será un punto definitivo para la coloración y la absorbancia que se obtendrá al realizar el proceso de espectrofotometría.
La gráfica nos arroja como resultado un dato de r = 1.003 junto con los cálculos realizados, en este caso r debería de ser lo más cercano posible a uno para que se viera que los datos si están relacionados, es este caso los datos de concentración de la proteína y la absorbancia, entonces debido a que el dato de r es casi uno se observa que la absorbancia dependerá directamente de la concentración que haya de proteína en la mezcla que se presenta.
De acuerdo a los datos obtenidos por la gráfica que representa la cantidad de absorbancia de la proteína y con la curva patrón realizada con la albúmina, se tiene que según la teoría, los datos deberían de estar relacionados según el ajuste de mínimos cuadrados, es decir, debería de arrojarse como resultado que existe una relación entre la absorbancia y la concentración de la proteína, en este caso la teoría nos proporciona (al igual del punto anterior discutido) que realmente la cantidad de proteína será un punto definitivo para la coloración y la absorbancia que se obtendrá al realizar el proceso de espectrofotometría.
La gráfica nos arroja como resultado un dato de r = 1.003 junto con los cálculos realizados, en este caso r debería de ser lo más cercano posible a uno para que se viera que los datos si están relacionados, es este caso los datos de concentración de la proteína y la absorbancia, entonces debido a que el dato de r es casi uno se observa que la absorbancia dependerá directamente de la concentración que haya de proteína en la mezcla que se presenta.
Suscribirse a:
Entradas (Atom)